饲养密度对仔猪血清抗氧化、肝脏NAD+/NADH及嘧啶核苷酸代谢基因表达的影响

鲍彤彤 ，郜陆敏 ，张玉梅，吴 信，刘春龙

（1.中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑土区农业生态重点实验室，哈尔滨 150081；2.中国科学院亚热带农业生态研究所，畜禽养殖污染控制与资源化技术国家工程实验室，长沙 410125；3.中国科学院大学，北京 100049）

饲养密度是畜禽养殖重要参数之一，影响猪群健康和福利水平[1]。研究表明，饲养密度过低导致土地等资源浪费，增加猪维持净能，不利于脂质积累；饲养密度过高显著降低猪群平均日增重，不利于经济效益[2]。因此在实际生产中，选择合适饲养密度对于平衡经济效益和猪群健康至关重要。

动物遇到有害刺激时，可通过调节神经内分泌系统和行为反应规避应激对机体影响。饲养密度过高，个体活动空间受限，动物无法及时规避应激源，导致机体应激反应增加[3]。血液抗氧化指标常被认为是应激标志物[4]。研究表明，饲养密度过高破坏动物体内氧化还原稳态，导致机体活性氧（ROS）水平升高，造成氧化应激，影响各类代谢反应[5]。机体抗氧化防御系统是对抗ROS的主要防御机制之一，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）等[6]。核苷酸及其代谢产物在机体各项生命活动中均发挥重要作用，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是氧化还原反应中传递电子的辅酶，参与三羧酸循环、氧化磷酸化等[7]，同时也是嘧啶核苷酸合成重要物质[8-9]。尿苷可与脂肪组织、胆汁酸等共同作用，调控机体能量稳态[10]。饲粮中添加单磷酸尿苷或尿苷类核苷酸可促进断奶仔猪肠道发育，缓解断奶应激[11]。另外，饲粮中添加外源核苷酸可提高断奶仔猪免疫功能，提高机体抗应激能力，进而提高仔猪生长性能[12]。目前关于核苷酸代谢与应激研究多集中于添加外源核苷酸可缓解机体应激反应方面，但饲养密度是否影响仔猪核苷酸代谢尚未见报道。

因此，本研究探讨饲养密度对仔猪抗氧化能力、嘧啶核苷酸合成和转运相关基因表达的影响，旨在为生猪养殖业饲养密度合理选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取体重相近（10.32±0.07 kg）31 日龄仔猪（长白×大约克郡）66 头，随机分为3 组，每组6 个重复：A 组（低密度组）：2 m2内饲养2 头仔猪；B 组（中密度组）：2 m2内饲养3 头仔猪；C 组（高密度组）：2 m2内饲养6头仔猪。

1.2 饲养管理

仔猪饲粮组成参照NRC（2012），符合该阶段仔猪营养需求。仔猪自由采食，饮水充足。饲养前对猪舍全面消毒并保持干燥，圈舍温度18～26 ℃，舍内自然通风，试验期30 d。基础日粮组成及营养水平见表1。

1.3 样本采集

试验30d后，从各组随机抽取1头仔猪，禁食12 h，电击麻醉（120 V，200 Hz），颈静脉采血后屠宰取样。采集空肠和肝脏样品置于液氮速冻，于-80 ℃保存。血液样本室温静置2 h后，于4 ℃条件下，3 000 r·min-1离心10 min，取上层血清，于-80 ℃保存。

表1 基础日粮组成及营养水平Table 1 Basal diet composition and nutritional level

1.4 血清抗氧化指标测定

抗氧化相关试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国，南京）和多功能酶标仪（Infinite M200 PRO，瑞士）测定仔猪血清中过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）水平，具体操作参照试剂盒说明书。

1.5 肝脏NAD+/NADH测定

NAD+/NADH 检测试剂盒（WST-8 法）测定肝脏中NAD+与NADH 比值（碧云天生物技术有限公司，中国，上海）。根据试剂盒说明书操作后，用多功能酶标仪（Infinite M200 PRO，瑞士）检测吸光值。并根据以下公式计算样品中NAD+含量及NAD+/NADH 比值，NAD+和NADH 总量或各自含量用单位肝脏重量中含量表示。

1.6 总RNA提取与实时荧光qRT-PCR

取适量仔猪肝脏和空肠组织样，在液氮中磨成粉状后加入Trizol（碧云天生物技术有限公司，中国，上海），提取总RNA。总RNA浓度采用紫外比色法测定，RNA 质量通过琼脂糖凝胶电泳测定，并用DNase 去除DNA。反转录过程参照试剂盒说明书（TaKaRa 生物科技股份有限公司，中国，大连），即得到cDNA。

通过GenBank获取相关基因序列，Prime 5.0设计引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，qPCR 扩增反应中使用引物序列见表2。参照试剂盒（Takara SYBR II，中国，大连）说明书，使用罗氏荧光定量PCR 仪（LightCycler 480II，德国，瑞士）作PCR扩增，检测β-actin及核苷酸合成与转运等基因相对mRNA 表达水平。使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。

表2 qPCR扩增反应中正向和反向引物序列Table 2 Forward and reverse primer sequences in qPCR amplification reactions

1.7 数据处理与统计分析

采用SPSS 21.0 软件作单因素方差分析（ANO⁃VA），然后作Duncan 多重比较检验。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲养密度对仔猪血清抗氧化能力的影响

饲养密度对仔猪抗氧化指标影响如表3 所示。与低密度组相比，高饲养密度显著降低仔猪血清中CAT、GSH-PX和T-SOD水平（P＜0.05）。与中密度组相比，高饲养密度显著升高仔猪血清中丙二醛（MDA）水平，降低GSH-PX和T-SOD水平（P＜0.05）。

2.2 饲养密度对仔猪肝脏NAD+/NADH的影响

饲养密度对仔猪肝脏NAD+/NADH 的影响如图1所示，与低密度组相比，高饲养密度显著上调仔猪肝脏中NAD+/NADH比值（P＜0.05）。

表3 饲养密度对仔猪血清抗氧化能力的影响Table 3 Effect of stocking density on antioxidant capacity in serum of piglets

图1 饲养密度对仔猪肝脏NAD+/NADH的影响Fig.1 Effect of stocking density on the ratio of NAD+to NADH in liver of piglets

2.3 饲养密度对仔猪嘧啶核苷酸代谢相关基因mRNA表达的影响

饲养密度对仔猪肝脏嘧啶核苷酸合成相关基因mRNA 表达影响如图2 所示。与低密度组和中密度组相比，高饲养密度极显著下调仔猪肝脏中尿苷单磷酸合成酶（UMPs）mRNA 表达水平（P＜0.01）。与低密度组相比，高饲养密度组显著上调肝脏中核糖核苷酸还原酶M（RRM）mRNA表达水平（P＜0.05）。

饲养密度对仔猪空肠嘧啶核苷酸合成相关基因mRNA 表达影响见图3。与低密度组和中密度组相比，高饲养密度显著上调仔猪肠道中氨甲酰磷酸合成酶2、天冬氨酸氨甲酰基转移酶和二氢羟色胺酶尿苷单磷酸合成酶（CAD）mRNA 表达水平（P＜0.05）。与低密度组相比，高饲养密度极显著上调肠道中UMPs的mRNA表达水平（P＜0.01）。

饲养密度对仔猪空肠嘧啶核苷酸转运相关基因mRNA 表达影响如图4 所示。与低密度组相比，高饲养密度显著上调仔猪肠道中嘧啶核苷酸转运相关基因SLC28A1、SLC28A2和SLC28A3的mRNA表达水平（P＜0.05）。与低密度组相比，中密度组SLC28A3的mRNA表达水平也显著上调（P＜0.05）。

图2 饲养密度对仔猪肝脏核苷酸合成相关酶mRNA表达的影响Fig.2 Effect of stocking density on mRNA expression of nucleotide synthesis related enzymes in liver of piglets

图3 饲养密度对仔猪空肠核苷酸合成相关酶mRNA表达的影响Fig.3 Effect of stocking density on mRNA expression of nucleotide synthesis related enzymes in jejunum of piglets

图4 饲养密度对仔猪空肠核苷酸转运相关基因mRNA表达的影响Fig.4 Effect of stocking density on mRNA expression of nucleotide transport-related genes in the jejunum of piglets

3 讨 论

3.1 饲养密度对仔猪血清抗氧化能力的影响

氧化应激是指动物体内氧化与抗氧化作用失衡，产生大量自由基，引起机体氧化损伤[13]。在集约化养殖过程中，应激源无处不在，对机体氧化还原稳态产生不利影响[14]。研究表明，高饲养密度增加机体内自由基产生，破坏机体氧化还原稳态[15]。本研究中，高饲养密度显著降低仔猪血清中CAT、GSH-PX和T-SOD水平，与高饲养密度显著降低大菱鲆血清中SOD、GSH-PX、CAT 等抗氧酶指标结果一致[16]。试验结果表明，高饲养密度可能破坏仔猪氧化还原稳态，导致机体易受自由基攻击，产生氧化损伤。

MDA 是反映氧化应激中脂质过氧化水平重要参数[17]。研究表明，高饲养密度引起肉鸡氧化应激，血清中MDA 水平显著升高[18]。氧化应激破坏ROS 产生与抗氧化系统之间平衡，刺激ROS 形成，导致脂质过氧化增加[19]。本研究中，与中密度组相比，高饲养密度组仔猪血清中MDA 水平显著升高，与高饲养密度显著增加肉鸡血清中MAD 结果一致，表明高饲养密度引起仔猪氧化应激。

3.2 饲养密度对仔猪肝脏NAD+/NADH的影响

肝脏是哺乳动物最重要代谢器官，参与糖、脂、蛋白、核苷酸等多种代谢反应。NAD+作为一种传递电子辅酶，几乎参与肝脏中各类代谢反应，在糖酵解、糖异生、三羧酸循环等能量代谢中发挥不可替代作用[20]。研究表明，降低NAD+/NADH 比值可通过催化α-酮戊二酸脱氢酶（A-KG⁃DH）活性促进ROS 产生[21]。NAD+也是蛋白质相互作用和DNA 修复的一种关键调节分子，NAD+可通过提高PPAR活性，提高细胞氧化损伤DNA修复能力[22]。另外，NAD+通过激活SIRT1，修复氧化损伤的血管[23]。本研究中高密度组肝脏NAD+/NADH 比值显著高于低密度组，可能是高饲养密度条件下肝细胞自我保护机制，机体通过上调NAD+/NADH比值抑制ROS产生，减轻肝脏细胞氧化损伤。

3.3 饲养密度对仔猪嘧啶核苷酸代谢相关基因mRNA表达的影响

仔猪合成嘧啶核苷酸主要包括从头合成和补救合成两种途径。从头合成主要发生于肝脏，需消耗大量能量。补救合成则可利用体内游离的核苷和碱基，经简单反应生成嘌呤核苷酸，该过程耗能较少。本试验中，高密度组仔猪肝脏中嘧啶核苷代谢从头合成关键酶UMPs 的mRNA 表达量显著降低，而补救合成关键酶RRM 的mRNA 表达量较低密度组显著升高。Ghoshal 等比较分析肝脏代谢组学，发现肝脏受到损伤时，核苷酸及其代谢产物均受影响[24]。因此推测，本试验中从嘧啶核苷酸头合成相关基因表达受抑制可能与高饲养密度引起仔猪肝脏氧化损伤有关。此外，动物处于应激状态时，需更多能量应对机体应激综合反应，维持内环境稳定[25]。研究表明，补充外源核苷酸可调控能量代谢，结合上述肝脏NAD+/NADH 结果，提示高饲养密度可能通过影响仔猪核苷酸代谢调控机体应激状态下能量代谢[26-27]。由于补救合成节省能量和氨基酸消耗，因此推测高饲养密度对肝脏嘧啶核苷酸合成的影响也可能是机体在应激状态下自我调节，但具体调控机制尚不明确，需进一步探究。

机体处于应激状态时对核苷酸需求量迅速增加，核苷酸促进肠道细胞增殖和组织修复，研究表明，添加外源核苷酸有效增加断奶仔猪肠道绒毛高度和隐窝深度、促进细胞增殖，缓解断奶应激[28]。但也有研究发现，在未出现应激反应仔猪日粮中添加外源核苷时，仔猪肠道结构未有明显改变[29]，说明肠道对核苷酸需求可能与机体健康相关。本试验中，高饲养密度组仔猪肠道中嘧啶核苷酸合成和转运关键酶CAD、UMPs、SLC28A1、SLC28A2 和SLC28A3 的mRNA 表达量均显著上调，可能与应激状态时小肠对核苷酸需求量增加有关。

4 结 论

综上所述，高饲养密度降低仔猪抗氧化能力，影响嘧啶核苷酸合成和转运，可能与高饲养密度引起仔猪应激反应有关。因此，集约化养殖模式下，应注意饲养密度过高带来的不利影响，合理选择饲养密度。