外泌体在心血管疾病中的研究进展

梁艳胜，刘文卉，盛其萍，刘平

（山东大学第二医院心血管内科，山东 济南 250033）

《中国心血管疾病报告2018：最新摘要》中显示心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的发病率不断增加，预计在未来十年内将继续呈上升趋势；目前40%的居民死亡归因于CVD，高于因癌症或其他疾病引起的死亡率[1]。由此可见，我国CVD 的发展情况不容乐观。近年来，随着对外泌体研究的逐渐深入，外泌体在CVD中的抗炎、改善心室重构、促进血管新生等作用受到越来越多学者的重视[2-4]。本文就外泌体在CVD中发病机制、诊断、治疗的研究进展进行综述。

1 外泌体概述

外泌体是一类大小约40～100 nm，具有脂质双分子层膜结构的细胞外囊泡，内含蛋白质、脂质、mRNA、miRNA、DNA 等生物分子。可由B淋巴细胞、血小板、少突胶质细胞、树突状细胞、肥大细胞、脂肪细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和干细胞等多种细胞产生，广泛分布在唾液、羊水、血液、尿液、母乳、脑脊液、淋巴液等多种体液中[5-6]。在不同的病理生理条件下不同的细胞会产生不同类型的外泌体，通过细胞间通讯发挥生物学功能。

2 外泌体与心血管疾病

2.1 动脉粥样硬化 动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症反应。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）通过刺激巨噬细胞和内皮细胞，在AS 的发生发展中具有重要作用。研究发现，用ox-LDL刺激小鼠和人的巨噬细胞，分离外泌体并进行鉴定，发现外泌体miR-146a 可以通过减少细胞迁移、促进巨噬细胞在血管壁的包裹以及诱导氧化应激等方面加速AS 的发展[7-8]；采用ox-LDL 处理血管内皮细胞时，可通过外泌体miR-155、miR-505、lncRNA-MALAT1 影响巨噬细胞转化、诱导中性粒细胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）形成、触发高脂血症、炎症反应等方面，加重AS 的发生[9-12]。但是也有很多外泌体在AS中发挥保护作用。Shan等[13]证实lncRNA-RNCR3 在内皮细胞和血管平滑肌细胞中表达，与Kruppel 样因子 2（Kruppel like factor 2，KLF2）和 miR-185-5p形成反馈环，调节细胞功能，具有AS保护作用。Chen等[14]在研究中发现抑制lncRNA-GAS5 可以抑制内皮细胞的凋亡，也可以发挥抗AS的作用。由此可见，不同的外泌体既可以加重AS，也具有AS保护作用。

此外，还有很多细胞来源的外泌体通过核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途径影响AS 的发生。Gao 等[15]从骨髓树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）培养液中分离出外泌体，用这些外泌体刺激人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），观察到这些外泌体可以通过肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）介导的NF-κB 途径增加内皮炎症；同时该课题组还在体内研究中发现ApoE小鼠注射BMDCs 分泌的外泌体12 周后，AS 病变明显增加。但是，Li 等[16]发现经低强度脉冲超声（low intensity pulsed ultrasound，LIPUS）处理的 BMDCs 来源的外泌体miR-16 和miR-21，可以通过抑制NF-κB 信号通路而抑制TNF-α诱导的内皮炎症反应。也有学者发现血小板源性外泌体中miR-21、miR-25-3p、miR-223和miR-339的水平升高，可作用于NF-κB 信号通路，抑制促炎因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、细胞间粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和TNF-α的表达，减轻AS小鼠模型的血管内皮细胞炎症[17-18]。Shi等[2]在研究中指出人单核细胞系的细胞外囊泡中含有外泌体血清热休克蛋白27（heatshock protein 27，HSP27），通过Toll样受体4（tolllikereceptor4，TLR4）激活NF-κB，促进NF-κB依赖性的抗炎因子白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的释放，减轻炎症反应和AS 的发生。总的来说，外泌体也可以通过作用于NF-κB通路，影响抗炎因子和促炎因子的表达，从而影响AS的进展。

2.2 急性心肌梗死 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，是心血管疾病患者死亡的主要原因。近年来的研究表明，外泌体在AMI 的诊断和治疗方面具有重要作用。Su 等[19]对 6 例 AMI 和 6 例稳定性冠心病患者 miRNAs 的差异表达分析中发现外泌体miR-3、miR-4、miR-507、miR-656 和miR-1915-3p在AMI标本中的表达明显低于在稳定性冠心病标本中的表达，说明外泌体miRNAs可能成为协助诊断AMI的指标。另外，多种干细胞来源的外泌体在AMI中的治疗作用越来越受到广大研究人员的重视：Zhang等[20]用左前降支结扎法构建大鼠AMI模型，将低氧预适应的骨髓间充质干细胞（bonemesenchymal stem cells，BMSCs）外泌体注射到大鼠心肌内，发现AMI大鼠的miRNA-24水平上调，通过miRNA-24的上调可以抑制心肌细胞凋亡，缩小心肌梗死面积，改善心功能。Huang等[4]还发现如果采用AMI后第30分钟心肌内注射BMSCs 中分离出的外泌体联合AMI 后第3 天进行BMSCs 移植的办法，也可以减小心肌梗死面积，增加新血管形成，使心脏功能得到最大的改善。Ju 等[21]将心脏间充质干细胞（cardiac mesenchymal stem cells，CMSCs）分泌的外泌体通过心肌内注射的方式注射到小鼠心肌梗死边缘区，证实心肌梗死后心肌内注射CMSCs 分泌的外泌体可促进心肌细胞增殖和心脏血管生成，保护心功能。Pan 等[22]构建大鼠AMI和缺氧诱导的H9C2 的体内体外模型，发现来自miR-146a 修饰的脂肪干细胞（adipase derived stem cells，ADSCs）的外泌体通过下调早期生长反应因子1（early growth response 1，EGR1），能够逆转AMI 或缺氧诱导的TLR4/NF-κB信号的激活，抑制细胞凋亡、炎症反应和心肌纤维化，减轻AMI诱导的心肌损伤。

2.3 心力衰竭 心力衰竭（heart failure，HF）是多种心血管疾病的终末状态，病理上有心肌细胞肥大、心肌纤维化等表现。有研究表明外泌体可以影响HF的病理变化：Nie等[23]在慢性心力衰竭患者及心功能不全小鼠动物模型中均发现miR-217表达明显增加，并证实miR-217通过调节磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）加剧了心肌肥大、纤维化和心功能不全。也有学者发现外泌体可能成为HF诊断的生物标志物：Wang等[24]在31例HF患者血浆中提取的外泌体及血管紧张素Ⅱ处理的心脏成纤维细胞中分泌的外泌体中均检测到miR-425和miR-744表达下调。胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白过表达时可以使miR-425 和miR-744 下调，进而导致心脏成纤维细胞纤维化，而在培养的心脏成纤维细胞中过表达miR-425或miR-744时可显著抑制血管紧张素诱导的胶原形成和纤维化形成。由此推测，miR-425 和miR-744 的下调可能与心肌纤维化和HF 有关。还有研究人员发现外泌体在HF 中可能具有治疗作用：Qiao 等[3]从HF 患者的外源性基质细胞中分离出外泌体，发现这些外泌体在体外会破坏心肌细胞增殖及内皮管形成的能力，在体内会加重左心室重构。进一步研究发现在这些外泌体中miR-21-5p 表达异常 ，miR-21-5p 可以通过抑制 PTEN 增强Akt 激酶活性，促进血管生成和心肌细胞存活。因此，恢复HF 患者体内miR-21-5p 的表达可能有利于HF 患者的治疗，这也为HF的治疗提供了新的手段。

2.4 肺动脉高压 肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）指肺动脉压力升高超过一定界值的一种血流动力学和病理生理状态，可导致右心衰竭和肺血管重构。外泌体在PH中的作用与肺动脉内皮细胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）和肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cell，PASMCs）增殖和抗凋亡有关。Zhang 等[25]将ADSCs 与野百合碱吡咯（Monocrotaline pyrrole，MCTP）处理的人PAECs 共培养，发现ADSCs 源性外泌体可以促进MCTP处理的人PAECs的增殖。将ADSCs移植后，使用野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导的PH 大鼠模型中也观察到了类似的结果。进一步研究表明，这些作用的产生可能与miR-191 调节骨形态发生蛋白受体2（bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2）有关。Zhao 等[26]用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导 PAECs 损伤后 ，将PAECs 与PASMCs 共培养后发现LPS 可促进PAECs 释放外泌体，并且外泌体的释放与LPS浓度呈正相关，用LPS处理后的PAECs 来源的外泌体可以内化到PASMCs 内，促进PASMCs 增殖，诱导PASMCs 抵抗凋亡。也有外泌体在PH 的诊断中存在一定价值：Ferrer等[27]将内皮细胞和PASMCs共培养时发现，外泌体可以将翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein，TCTP）从内皮细胞转移到PASMCs，表明内皮源性TCTP具有促进增殖和抵抗凋亡的作用。同时还在PH 动物实验模型和特发性PH 患者中均发现TCTP 水平升高，也说明TCTP可能成为PH发生发展的潜在生物标志物。当然，还有学者发现了干细胞来源外泌体在PH 中的治疗作用：Zhang等[28]建立MCT诱导的大鼠PH模型和缺氧诱导的细胞损伤模型，用人脐带间充质干细胞培养上清液中的外泌体进行干预处理，发现这些外泌体可能通过上调PH 大鼠和缺氧性肺血管细胞Wnt5a的表达，在体内可明显减轻PH大鼠右心室肥厚和肺血管重构，在体外能显著抑制缺氧诱导的PAECs 凋亡和PASMCs 的增殖，这为日后治疗PH 提供了新的思路。

2.5 糖尿病性心肌病 2013 年进行的一项全国流行病学研究显示中国成年人的总体糖尿病标准化患病率约为10.9%，患有糖尿病的成年人比没有糖尿病的成年人具有更高的全因死亡率，CVD 引起的死亡率增加最为明显[1]。部分糖尿病患者后期可能出现糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM），最终可能进展为HF、心律失常及心源性休克。

DCM 具有心肌微血管内皮细胞（cardiacmicrovascularendothelialcells，CMECs）损伤、心肌细胞（cardiomyocyte，CM）功能障碍、心肌脂肪变性等特征。Hu 等[29]建立了内皮特异性Mst1转基因小鼠以及链脲佐菌素诱导的糖尿病模型。发现转基因小鼠分离的CM 中Mst1 蛋白含量增加，心功能更差，胰岛素抵抗更严重。在体外实验中，CM 可摄取CMECs 来源的外泌体，也可以增加Mst1 蛋白含量，抑制高糖培养CM 的自噬，促进细胞凋亡。Mst1 还可以通过减少死亡结构域相关蛋白（death domain-associate protein，DAXX）和葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）之间的相互作用，增强Mst1 和DAXX 的结合，破坏GLUT4 的膜转位，抑制葡萄糖摄取。由此可见，DCM 的发病机制可能与CMECs 释放的富含Mst1 的外泌体在抑制CM 自噬、促进凋亡和抑制糖代谢等方面的作用有关。有些外泌体在DCM 中也存在预测作用：de Gonzalo-Calvo 等[30]在排除干扰因素的情况下分析了2型糖尿病患者血清中心肌细胞富集的miRNA水平，并与年龄及体重指数相同的志愿者、高脂饮食喂养的小鼠模型血清和脂质负载的HL-1 细胞外泌体中的miRNA 进行分析 ，发现 miR-1 和 miR-133a 水平较高 ，推测 miR-1 和miR-133a可能是心肌脂肪变性的独立预测因子。也有一些学者发现了干细胞源性外泌体在DCM 中的治疗作用：Lin等[31]在动物实验中将大鼠分为对照组、糖尿病对照组和BMSCs 外泌体组。与糖尿病对照组比较，发现经BMSCs 来源的外泌体处理后，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和Smad 2 mRNA 表达水平降低，TGF-β1 和Smad2 蛋白的表达下调，左心室胶原水平明显降低。推测BMSCs来源的外泌体可能通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路改善糖尿病心肌损伤和纤维化。

2.6 心房颤动 心房颤动（atrial fibrillation，AF）是一种常见的心律失常，可出现HF、脑卒中等严重并发症。目前外泌体和AF 的研究相对较少，主要集中在AF 的诊断方面。Wang 等[32]对持续性AF 和窦性心律患者血浆外泌体miRNAs的表达水平进行高通量测序并对AF的危险因素进行分析时发现：单因素Logistic 分析显示miR-142-5p、miR-223-3p、miR-483-5p与AF相关，多因素Logistic分析显示miR-483-5p与AF独立相关。Mun等[33]从室上性心动过速患者、阵发性AF 和持续性AF 患者血清中分离外泌体进行检测，还发现在持续性AF患者中miRNA-103a、miRNA-107、miRNA-320d、miRNA-486 和miRNA-let-7b 的表达水平较高。可以发现，血浆外泌体miRNAs 水平可能成为诊断AF 的生物标志物。Liu等[34]还在研究中发现ADSCs 来源的外泌体miR-320d 通过下调STAT3，可以抑制AF心肌细胞凋亡。这对于外泌体指导AF的治疗提供了帮助，而外泌体在AF 中是否还有其他治疗作用可能需要进一步的探索。

3 展望

自外泌体发现以来，其在CVD中的作用就引起了许多学者的关注。外泌体通过在细胞间的通讯作用，已经在多种CVD的发病机制、诊断、治疗中体现了其价值。但是，外泌体在CVD的研究依旧处于初级阶段，还有很多问题需要进一步解决，未来的发展方向可能集中于以下几个方面：①外泌体的提取、纯化方法及过程较为复杂，且价格昂贵，在很多中心尚不能开展，需要进一步解决。②探讨外泌体在lncRNA-miRNA-蛋白及信号通路中的作用，进一步了解外泌体在CVD中的发病机制。③探索外泌体在CVD 中作为疾病诊断或评估疾病预后的生物标志物的作用。④不同干细胞来源外泌体在CVD中的治疗作用已被发现，但是如何靶向输送仍需要进一步研究。