组蛋白甲基化及其抑制剂对结直肠癌进展的影响

刘凯 王粹

天津医科大学肿瘤医院结直肠肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心

0 引 言

结直肠癌是发生于结肠或直肠的恶性肿瘤，在中国其发病率较高，在消化道恶性肿瘤中其发病率仅次于胃癌及食道癌，尤其是直肠癌更加普遍[1]。在肿瘤相关死亡原因中，结直肠癌于男性中居第5位，女性中居第6位，且近年来其发病率日渐增长。结直肠癌易发于40岁以上的中老年人中，往往缺少显著的早期症状，而在中后期会出现剧烈腹痛、便血、胃肠道功能紊乱等症状[2]，患者在确诊时往往已处于进展期。因此，结直肠癌的早期发现与精准治疗十分关键。结直肠癌的主要危险因素包括饮食习惯、结直肠炎症等，其与患者的遗传因素也有密不可分的联系[3]。近年来，在传统的手术治疗、放射治疗和化学治疗的基础上，靶向治疗方式初见端倪，多种针对结直肠癌的治疗靶点被发现，并且相关抑制剂已用于临床或处于临床试验阶段[4]。但为了提高结直肠癌的预后，仍然需要进一步阐明结直肠癌的发病机制，找出调控结直肠癌进展的关键因子。

值得注意的是，多种与基因表达调控相关的蛋白参与结直肠癌的进展和转移，这些基因的调控作用往往通过表观遗传的方式实现[5]。其通过对组蛋白及DNA翻译后修饰的调控，能够进一步影响结直肠癌的多种细胞功能，包括增殖、迁移、侵袭、凋亡、自噬及耐药等[6]。目前已经发现多种参与表观遗传的酶或其他蛋白，其突变后能够促进结直肠癌的进展，因此可作为潜在的结直肠癌治疗靶点[7]。多种表观遗传修饰的异常改变能够促进结直肠癌的进展，如组蛋白甲基化、乙酰化等[8]。其中，组蛋白甲基化是一种重要的组蛋白修饰手段，其调控基因的转录激活及抑制过程[9]。目前已有大量研究结果证实组蛋白甲基化对结直肠癌的进展产生影响，相关甲基化及去甲基化的抑制剂可作为潜在的结直肠癌治疗药物[10]。

1 组蛋白甲基化修饰及其调控方式

表观遗传修饰是一种真核细胞在长期进化过程中形成的精确调控基因表达的手段，主要包括DNA修饰及组蛋白修饰[11]。其中，组蛋白修饰是一种调控基因表达的重要方式，主要通过各种酶促进组蛋白的修饰，从而改变染色质结构，影响相关下游基因的转录活性，调控基因表达水平。在哺乳动物的染色体中，组蛋白往往以八聚体的形式存在（包括2个组蛋白H2A，2个H2B，2个H3及2个H4）[12]。八聚体组蛋白被147 bp的DNA缠绕，组成核小体的核心。这些组蛋白的N端游离于核小体外，从而发生特定修饰，包括甲基化、乙酰化、泛素化、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)核糖基化和腺苷酸化等，进一步调控转录。

组蛋白甲基化修饰是一种重要的组蛋白修饰，主要由特定的甲基转移酶和去甲基化酶参与，起到“笔”和“橡皮”的作用，从而在组蛋白的特定位点上发生甲基化和去甲基化[13]。其中，组蛋白的赖氨酸和精氨酸往往最易发生甲基化，而少数研究者认为组氨酸也可发生甲基化。赖氨酸的甲基化形式有单甲基化、二甲基化和三甲基化，而精氨酸只包括单甲基化及二甲基化。根据目前的报道，组蛋白甲基化主要发生于组蛋白H3及H4的N端尾部，而H2A和H2B上尚未发现甲基化位点。

近年的研究结果表明，组蛋白H3包括众多可发生甲基化的位点，如第4、9、26、27、36、56、79位赖氨酸，以及第2、8、17位精氨酸，均可发生甲基化修饰[14]。而组蛋白H4的甲基化修饰位点较少，主要包括第5，12及20位赖氨酸和第3位精氨酸。这一系列位点的甲基化具有不同的转录调控功能，即有的甲基化位点能够促进基因转录，而个别甲基化位点可抑制基因转录过程。在组蛋白H3中，第4、26、36、79位赖氨酸和第8、17位精氨酸能够促进转录激活；而第9、7、56位赖氨酸能够抑制基因转录[15]。在组蛋白H4中，第12位赖氨酸和第3位精氨酸能够激活下游基因转录，而第5、20位氨基酸则抑制转录。有趣的是，不同的研究结果表明组蛋白H3的第2位精氨酸甲基化在不同条件下既可促进转录，又可抑制转录。

不同的组蛋白甲基化位点由特定的组蛋白甲基转移酶催化甲基化过程，而由特异的去甲基化酶参与去甲基化过程。在这些酶的精确调控下的组蛋白甲基化是一种稳态过程，进一步影响胚胎发育和多种生理功能。而这些酶的功能异常或缺陷会导致一系列严重疾病，包括肿瘤[16]。有研究结果表明，组蛋白H3的第4位赖氨酸（H3K4）由一系列甲基化酶调控其甲基化，包括混合谱系白血病（m ixed lineage leukemia，ML L）家 族 蛋 白MLL1~MLL4、SET1A/SET1B，和组蛋白甲基转移酶（SET and MYND domain containing protein，SMYD）的SMYD1~SMYD3等，而赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶(lysine specific demethylase，LSD)家组蛋白LSD1、LSD2及JARID1A、JARID1D等蛋白催化其去甲基化。另外，组蛋白H3K9的甲基转移酶主要包括G9α、胰高血糖素样肽（gl ucagon-like peptide，G LP）、组蛋白赖氨酸甲基化转移酶（SET domain bifurcated 1，SETDB1）及PR结构域蛋白（P RDI-BF1 and RIZ homology domain containing protein，PRD M）家族蛋白等，而LSD1及Jumonji特征结构域的组蛋白去甲基化酶（Ju monji domain containing histone demethylase，JHDM）家族的JHDM2、JHDM3则参与催化其去甲基化的过程[17]。有个别酶能够参与催化不同的位点甲基化，如共激活因子相关精氨酸甲基转移酶1（co activator-associated arginine methyltransferase 1,CAR M1）可催化组蛋白H3的第17位精氨酸和第26位赖氨酸的甲基化，而G9α除催化H3K9的甲基化外，也能催化第56位赖氨酸的甲基化过程。最新的研究结果证实，C21orf127作为一个新发现的组蛋白甲基转移酶，可特异性地催化组蛋白H4K12的甲基化过程。尽管绝大多数甲基化位点的甲基转移酶和去甲基化酶被发现，而截至目前，仍然不清楚组蛋白H3的第8、17位精氨酸，第26、79位赖氨酸，以及组蛋白H4的第5、12位赖氨酸的特异性去甲基化酶[18]。同时，组蛋白甲基化与其他组蛋白修饰，如乙酰化修饰等，协同发挥基因表达调控的作用。总之，揭示组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶的调控机制，有助于我们更进一步加深对真核生物基因表达调控，进一步影响肿瘤，特别是结肠癌进展的理解。

2 组蛋白甲基转移酶与去甲基化酶对结直肠癌进展的影响

结直肠癌是由遗传的连续积累和表观遗传学变化诱导正常腺上皮转化为浸润性腺癌[19]。遗传和表观遗传学改变均通过激活致癌基因或失活调节结直肠癌相关信号通路的肿瘤抑制因子来促进肿瘤形成[20]。这些途径包括WNT、TP53、TGF/BMP/SMAD、RTK、NOTCH、PI3K信号通路，这些通路会影响诸如增殖、迁移、分化、黏附和细胞死亡等功能[21]。它们还包括微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）、染色体不稳定性（chromosome instability，CIN）和CpG甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）途径，调节基因组稳定性[22]。

近年来，表观遗传改变在结直肠癌中的重要性得到广泛认识。表观遗传学改变影响表观遗传学调控的许多组成部分，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、核小体占用和重塑、染色质环化和非编码RNA等，并通过影响癌症相关途径而促进结直肠癌的发展[23]。DNA甲基化是癌症中最能被充分表征的表观遗传学改变之一。像DNA甲基化一样，组蛋白修饰经常与结直肠癌相关联[24]。组蛋白修饰是重要的表观遗传标记，可通过影响染色质结构，募集重塑酶或转录复合蛋白来调节基因的转录、修复、复制和重组。在组蛋白中发现了许多修饰，涉及乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和类泛素蛋白修饰分子（small ubiquitin-like modifier，SUMO）化[25]。然而，尽管近年来研究者在结直肠癌的组蛋白甲基化方面关注较少，但该领域的进展较快。组蛋白甲基化调节剂已进入晚期实体瘤的临床试验，这为调节组蛋白甲基化作为结直肠癌的新疗法提供了基础[19]。

结直肠癌中组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase，HMT）和人双微球蛋白（human double minute，HDM）调控组蛋白甲基化[26]。靶向组蛋白甲基化酶可以恢复正常的甲基化水平，因此具有成为治疗药物的潜力。在87种组蛋白甲基化酶中，包括60种HMT和27种HDM，其中25种酶与结直肠癌有关联[27]。赖氨酸特异性甲基转移酶2B（lysine-specific methyltransferase 2B，KMT2B）/MLL4，KMT2D/MLL2和SETD1A都是H3K4甲基转移酶，促进了结直肠癌的发展。敲除KMT2B可抑制结直肠癌异种移植裸鼠肿瘤生长。在癌细胞中，KMT2B调节了关键的细胞周期调节基因的表达[27]。而敲除KMT2B则影响细胞周期进程并诱导细胞凋亡。此外，在结直肠癌患者的样本和细胞系中发现，与邻近的良性黏膜相比，在肿瘤组织中KMT2D水平显著升高[28]。在人类结直肠癌细胞和患者样本中，SETD1A和H3K4me3的水平升高。而SETD1A的下调则抑制了结直肠癌细胞的生长，并影响了约50%的WNT靶基因[29]。

作为H3K4去甲基化酶，赖氨酸特异性脱甲基酶1A（lysine-specific demethylase 1A，KDM1A)/LSD1和KDM5B/JARID1B也促进了结直肠癌的发展，这表明H3K4甲基化与结直肠癌更好地相关[30]。在结肠癌标本中发现了KDM1A的过度表达，并与晚期肿瘤结点转移阶段和转移有关[31]。人结直肠癌细胞116（human colon cancer cells 116，HCT116）中KDM1A的耗尽导致体外和体内细胞增殖的减少。KDM5B参与结直肠癌的维持，而KDM5B的耗尽导致上皮分化的丧失和结直肠癌细胞生长的抑制[29]。色斑3-9抑制因子同源物1（suppressor of variegation 3-9 homolog 1，SUV39H1）和PRDM16是两种H3K9甲基转移酶，研究者发现其与结直肠癌有关。在219个结直肠癌病例中，有25%的SUV39H1 mRNA水平升高。SUV39H1催化的H3K9me3在结直肠癌组织的浸润区域中增加[32]。SUV39H1可参与结直肠癌细胞迁移的调控，是结直肠癌中的一种癌蛋白[33]。EHMT2/G9a负责H3K9（H3K9me2）的二甲基化。最近，发现常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2 euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2，EHMT2）在结直肠癌肿瘤组织中的表达要比在肿瘤周围的组织高[34]。通过抑制EHMT2抑制了结直肠癌细胞的增殖并诱导DNA损伤。这些结果表明EHMT2调控结直肠癌进展[35]。KDM4B和KDM4C都是H3K9的去甲基化酶。KDM4B的高表达与结直肠癌患者的侵袭有关。KDM4B在结肠和直肠腺癌中表达上调，刺激了β-catenin表达和结肠癌细胞的生长。下调KDM4B，影响β-catenin/TCF4通路，进一步影响结肠癌生长[36]。在结肠癌细胞系中发现了KDM4C的过度表达，而KDM4C的下调导致结肠癌细胞的生长和克隆形成能力降低。

Zeste同源物增强子2（e nhancer of Zeste homolog 2，EZH2）能够甲基化H3K27。在结直肠癌患者中，与相邻的非肿瘤组织相比，在肿瘤组织中发现了EZH2过表达[37]。EZH2受细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和VAKT小鼠胸腺瘤病毒癌基因（AKT）途径调节，导致结直肠癌上皮间充质转化的改变。维生素D受体（vitamin D receptors，VDR）也已被确定为EZH2靶标。而VDR的下调则有助于EZH2诱导的结直肠癌细胞侵袭[38]。减少EZH2导致SW620细胞的增殖和迁移受到抑制，并促进细胞凋亡。这些结果表明EZH2作为一种癌蛋白深深地参与了结直肠癌的癌变过程。

类端粒沉默干扰体1（disruptor of telomeric silencing 1-like，DOT1L）是唯一使H3K79甲基化而不包含SET结构域的甲基化酶[39]。结直肠癌组织中高DOT1L的表达水平是预后不良的因素，并且发现白细胞介素22（interleukin-22，IL-22）依赖性结肠癌的干性受H3K79甲基化的影响，而受DOT1L的调节[40]。当使用选择性DOT1L抑制剂EPZ004777进行治疗时，原发性结肠癌球的形成受到抑制[41]。SMYD3，H4K5的甲基转移酶，在大多数结直肠癌中过表达。SMYD3的过表达被认为是由Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog，KRAS）突变诱导[42]。抑制SMYD3可抑制结直肠癌细胞增殖。WHSC1/MMSET/NSD2负责H4K20的甲基化[43]。Wolf-Hirschhorn综合征候选 者 1（Wo lf-Hirschhorn syndrome candidate 1，WHSC1）蛋白在包括胃癌、结肠癌、肛管癌在内的胃肠道癌中高表达，其表达水平与肿瘤的侵袭性相关。WHSC1可能是结直肠癌中潜在的癌蛋白，但这种作用尚待确定。CARM1，也称为蛋白质精氨酸甲基转移酶4（prot ein arginine methyltransferase 4，PRMT4），能够甲基化H3R17和H3R26[44]。CARM1在人结肠癌细胞中过表达，并促进β-catenin介导的基因表达。CARM1减少会抑制克隆存活和生长。PRMT5催化H3R8和H4R3上对称的二甲基化，并诱导转录抑制[45]。发现PRMT5在结直肠癌肿瘤组织中高表达，并且与患者预后有关。抑制PRMT5会下调癌基因成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor，FGFR3）和真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)的表达，从而导致结直肠癌细胞增殖和集落形成受到抑制[46]。

3 组蛋白甲基化相关抑制剂对结直肠癌进展的影响

鉴于许多组蛋白甲基化酶在结直肠癌的发展中起着重要作用，通过小分子靶向组蛋白甲基化酶或去甲基化酶，从而影响酶的功能可能是结直肠癌的有效疗法。当前，在临床前研究中已经有许多靶向组蛋白甲基化酶的小分子被用于结直肠癌治疗。例如，EPZ00477是有效的DOT1L抑制剂，通过EPZ004777进行的治疗可抑制原发性结肠癌的形成，并在体外抑制DLD-1细胞系生长。SMYD3抑制剂BCI-121可抑制结直肠癌细胞的生长[47]。Chaetocin是一种真菌代谢产物，可有效抑制SUV39H1，Chaetocin抑制SUV39H1的活性对结直肠癌细胞的迁移具有重要影响[48]。BIX01294和UNC0638是两种有效的EHMT2选择性抑制剂，可抑制结直肠癌细胞系的增殖[49]。DZNep是一种EZH2抑制剂，可促进结直肠癌细胞系和结肠癌干细胞的凋亡。EZH2抑制剂GSK346减少了结直肠癌细胞的迁移[50]。GSK126是EZH2的高度特异性抑制剂，使用GSK126处理Colo205和HT-29细胞系会降低H3K27三甲基化水平，从而对结直肠癌细胞增殖产生影响。AMI-1最初被报道为Ⅰ型PRMT抑制剂，可抑制结直肠癌细胞和异种移植小鼠模型的增殖[51]。

一般而言，当前针对组蛋白修饰酶的基于结构的药物设计工作主要集中在辅因子和底物结合位点。PKMT和PRMT使用常见的辅助因子S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）催化赖氨酸和精氨酸的甲基化[52]。DOT1L的有效和选择性抑制剂EPZ004777占据SAM结合位点[53]。西米芬净在SMYD3中采用了类似的结合模式。例如，CMPD-2在精氨酸腔内结合CARM1。将来应着重开发选择性和有效的组蛋白修饰酶小分子调节剂。首先，辅因子位点在结构上是保守的。它是小分子抑制剂（如辅因子类似物）的理想结合位点，但其最关键的问题是特异性差。为了提高选择性，同时占据辅因子和底物位点的双底物抑制剂具有较大潜力。

4 结 语

异常的组蛋白甲基化以及相关的蛋白与结直肠癌广泛关联。值得注意的是，一些与结直肠癌相关的组蛋白甲基化酶未被验证为药物靶标，包括JARID2、KDM3A、KDM3B、KMT2C，KMT2D、PRDM2、PRDM16、SETDB1和WHSC1。通过过表达，敲除或药理学抑制作用来调节结直肠癌细胞或动物模型中的这些酶，可能有助于阐明其在结直肠癌中的治疗价值。在结直肠癌的发展中，应更多地关注组蛋白甲基化酶的机制。我们知道，通过调节组蛋白甲基化谱，可以开启或关闭癌抑制基因或肿瘤抑制基因。但是，目前的数据表明这种调控可能是特定的，我们应该确切地找出哪些基因受组蛋白甲基化酶失控的影响。此外，组蛋白甲基化酶可以转录后调控非组蛋白，并影响其功能。一旦阐明了这些发病机理，就可以期待更精确的治疗方法。

结直肠癌中组蛋白甲基化的最新数据主要是临床前的。有趣的是，EZH2抑制剂EPZ-6438已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验，用于晚期实体瘤或B细胞淋巴瘤的治疗。在这个活跃领域中，我们期望在临床试验中有更多的用于结直肠癌的组蛋白甲基化干预疗法，鉴定新的组蛋白甲基化酶或去甲基化酶作为结直肠癌药物靶标，并在未来几年内发现新的组蛋白甲基化修饰特异性化学抑制剂。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突