柑橘黄龙病早期诊断的PCR检测技术优化

董宏图，王晓冬，侯佩臣，罗斌，李爱学，张晗*

(1.北京农业信息技术研究中心，北京 100094； 2.北京农业智能装备技术研究中心，北京 100094)

柑橘黄龙病(Citrushuanglongbing)，又名青果病、黄梢病，素有“柑橘癌症”之称，可导致柑橘果树的生长力逐渐衰弱(10年后死亡)，同时还会导致柑橘生产能力的突然丧失，是目前世界上柑橘类果树最具毁灭性的病害之一[1]。我国作为世界上的柑橘生产大国之一，该病的传播严重影响了我国柑橘产业的健康发展[2]。截至目前，全国有12个省有过柑橘黄龙病发生的报道，病害影响面积达柑橘总种植面积的80%以上[3]。由于柑橘黄龙病病菌生长在柑橘属植物韧皮部中，无法分离培养，一直不能确定其病原。直到20世纪90年代，才有相关研究确定了柑橘黄龙病病原为一种仅限于韧皮部筛管组织内寄生的革兰氏阴性细菌-韧皮部杆菌属类细菌(CandidatusLiberibacter)[4]。随后，依据其耐热性和地理分布的特性将柑橘黄龙病分为3个种：亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus，Las)、非洲种(CandidatusLiberibacterafricanus，Laf)和美洲种(CandidatusLiberibacteramericanus，Lac)。其中，亚洲种耐热性最强，其次是美洲种，非洲种的耐热性最差[5]。到目前为止，我国出现并检测到的病原均为亚洲种。由于黄龙病病原体具有很长的潜伏期，并且无法分离培养，所以早期检测与防治存在较大的困难。到目前为止，黄龙病检测的方法有很多种，如传统的田间诊断、指示作物检测法、显微镜观察等，这些方法虽成本较低、简单易行，但由于植株发病症状易与其他症状发生混淆，同时植株生长状况差异较大，使得这些方法难以广泛推广[6]。此外，还有血清学检测、高光谱检测等方法，但这些手段成本消耗高、过程繁琐[7]。随着分子生物学检测方法广为流行，最常用的是基于PCR技术的检测方法，这种方法操作简单快捷，检出结果灵敏精确[8]。但由于植株患病早期体内的黄龙病菌含量较低、分布不均匀，导致黄龙病早期诊断的可靠性较低[9]，引物与DNA模板浓度的不同也会对检测结果产生较大的影响[10]。

本实验在前人研究基础上选用使用率较高的几对引物进行比较，通过对PCR体系中的各物质浓度进行优化改进，提升引物的特异性与灵敏度[11]，筛选用于黄龙病菌检测的引物，优化检测反应体系，提高检测的准确度，为大规模均一化鉴定柑橘黄龙病提供一种快速低成本的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

黄龙病阳性样品：采自江西赣州某黄龙病重症果园的具有典型黄龙病斑驳症状的脐橙叶片。

黄龙病阴性样品：为本实验室培养的柑橘脱毒苗叶片。

特异性检测对照样品：从柑橘叶片分离培养的腐生菌。

空白对照：DNase-Free去离子水。

DNA提取试剂(CTAB法)、常规PCR试剂、DNA Marker D2000、琼脂糖、10 000×GeneGreen核酸染料由北京康润诚业生物科技有限公司提供。

1.2 方法

引物特异性实验。以柑橘叶片腐生菌、黄龙病菌DNA为模板，ddH2O为阴性对照，进行PCR扩增，通过对电泳结果分析，筛选出仅能扩增黄龙病菌的引物。

引物浓度优化。在20 μL的PCR反应体系下，引物的加入量分别为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 μL，PCR反应结束后，取5 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(70 V，50 min)，选出各引物的最适浓度。

引物灵敏度检测。将已知浓度的DNA溶液稀释10、100、200、500、800、1 000、1 500、2 000、2 500、5 000、8 000、10 000倍，分别作为模板，20 μL PCR体系：10 μL Mix，4 μL模板，各引物的最佳浓度，用ddH2O补足至20 μL，确定各引物所能扩增出目标产物的最低模板浓度，检测浓度最低的引物为灵敏度最佳引物。

根据相关文献报道，选取引物对LSS606/LAS[12]、P1/P2[13]、16sf/16sr[11]、OI1/OI2[8]、A2/J5[14]进行实验(表1)(引物由上海生工合成)。

表1 引物序列及预期扩增片段长度

DNA的提取(采用CTAB法)。将叶中脉剪成2～3 mm碎片，装入2 mL无菌离心管中，加入直径4 mm钢珠，在盛有液氮的泡沫盒中预冷3 min，放入磨样机研磨3 min，振频18 Hz；向离心管中加入预热的CTAB 800 μL，摇匀后放入水浴锅中65 ℃水浴，每10 min取出摇一次；45 min后，向离心管中加入24∶1氯仿异戊醇600 μL，充分混匀，12 000 r·min-1离心10 min；吸取400 μL上清液加入到1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻摇匀，12 000 r·min-1离心10 min；倒出离心管中液体，加入600 μL 75%乙醇，10 000 r·min-1离心5 min；倒出液体，室温干燥至白色沉淀变无色透明，加入50 μL ddH2O溶解30 min，存于冰箱-20 ℃备用。

1.3 PCR反应条件

PCR反应条件如表2所示，其中变性-退火-延伸设置35个循环。

表2 PCR反应程序

2 结果与分析

利用柑橘黄龙病DNA作为模板，分别对5对引物进行了PCR扩增，引物A2/J5、LSS606/LAS、16sf/16sr、P1/P2均能特异性扩增出黄龙病菌DNA对应的特征条带，未扩增出柑橘叶片腐生菌的条带；而引物OI1/OI2则扩增出2种模板的条带(图1)。说明引物对OI1/OI2特异性较差，因此，我们采用了其余几组引物进行下一步实验。

M为DNA marker；1～3为引物LSS606/LAS特异性检测结果；4～6为引物A2/J5特异性检测结果；7～9为引物P1/P2特异性检测结果；10～12为引物16sf/16sr特异性检测结果；13～15为引物OI1/OI2特异性检测结果。其中，每组模板顺序分别是黄龙病病菌、阴性对照、柑橘叶片腐生菌。图1 引物特异性的检测情况

2.2 引物浓度优化

对PCR反应体系中引物的浓度进行了优化，反应体系见表3，电泳结果见图2。

左上图为引物16sf/16sr浓度优化结果，右上为LSS606/LAS浓度优化结果，左下为A2/J5浓度优化结果，右下为P1/P2浓度优化结果；1～6引物浓度依次为0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5 μmol，M为DNA marker。图2 引物浓度优化的电泳结果

根据电泳条带结果显示，16sf/16sr最佳浓度为0.3 μmol，LSS606/LAS的最佳浓度为0.2 μmol，A2/J5的最佳浓度为0.25 μmol，P1/P2的最佳浓度为0.3 μmol，各引物的最终PCR优化体系见表3。

2.3 引物灵敏度检测

对模板DNA进行了不同倍数稀释，利用优化后的PCR反应体系，得到各引物能检测的最低模板浓度(图3)。

左上为引物LSS606/LAS，右上为引物P1f/P1r，左下为引物16sf/16sr，右下为引物A2/J5(1～12稀释倍数依次为10、100、200、500、800、1 000、1 500、2 000、2 500、5 000、8 000、10 000)。图3 引物LSS606/LAS，P1/P2，16sf/16sr与A2/J5灵敏度分析

根据电泳结果，引物P1/P2的最低检测限为0.24 ng·μL-1，16sf/16sr的最低检测限是0.48 ng·μL-1，引物LSS606/LAS、A2/J5对模板DNA的灵敏度最高，在模板浓度为0.048 ng·μL-1(稀释10 000倍)时仍能扩增出目标产物。

3 小结与结论

本研究共对5对引物的PCR反应体系进行了优化，分别为LSS606/LAS、16sf/16sr、A2/J5、P1/P2、OI1/OI2。研究结果显示，当引物浓度在0.2～0.3 μmol时，扩增效果最好；其中引物OI1/OI2的特异性最差，LSS606/LAS与A2/J5具有更好的灵敏度。本论文的实验结果，为柑橘黄龙病的后期检测以及防治研究提供了基础。

为保证实验的严谨性，实验中特异性、灵敏度及最佳引物浓度检测所用的模板均采用统一提取并混合均匀的柑橘黄龙病DNA，同时所有PCR循环次数均为35次，保证了所有实验过程的一致性。

考虑到柑橘叶片DNA提取过程中，除了黄龙病菌外，样品中可能还参杂有其他柑橘类病菌DNA干扰实验，造成假阳性情况。因此，本文首先对选取的5对引物进行了特异性实验。结果表明，供试的5对引物中，引物OI1/OI2除了目标片段还扩增出了柑橘叶片分离培养的腐生菌条带，特异性较差外，其余4对引物均特异性识别目标条带，具有较好的特异性。

在前人[9]的研究中，对PCR体系中的dNTPs、Taq酶、Mg2+、引物都分别进行过单因素的优化实验。但由于本实验中用到的是2×Taq PCR Mix，其中已经含有优化浓度的Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mg2+等预混合成分，所以本实验只针对引物浓度进行了优化设计。本实验通过设置0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5 μmol 6个引物浓度进行PCR扩增效果比较，结果显示，当引物浓度在0.2～0.3 μmol时，扩增条带清晰、形成引物间二聚体较少。在此基础上我们对各引物PCR体系进行了优化，确保引物灵敏度检测是在优化基础上进行的。另外本实验中采用了CTAB法提取样品DNA[15]，若使用DNA提取试剂盒，可以有效去除蛋白、多糖等杂质，提取到纯度较高的样品DNA，但是经过试剂盒中吸附柱的过滤与吸附以后，DNA产率会降低。植株叶片中病菌含量相对较少，所以为了更高效的提取到更大浓度的DNA，并且降低杂质污染，本实验采用优化的CTAB法提取样品DNA，提高了缓冲液中CTAB浓度和NaCl浓度，相对于传统CTAB法提高了提取效率，并可以有效去除杂质污染。

在灵敏度检测中，供试4对引物灵敏度大小依次为LSS606/LAS=A2/J5>16sf/16sr>P1/P2，灵敏度最高引物是最低引物的20倍，今后的早期检测中可以选用灵敏度最高的2对引物，更早的检测出柑橘果树的感病情况。这与高玉霞等[11]研究中，常规PCR检测柑橘黄龙病菌引物灵敏度16Sf/16Sr>P400f/P400r>P535f/P535r=OI1/OI2的部分研究结果一致。根据前人报道，新生叶片带菌量平均为1 ng总DNA中的CLas细菌数在8 869～15 739个[16]，那么通过本实验完善的检测体系，灵敏度最高的引物可检测出1 ng总DNA中的CLas细菌数在426～755个。利用本文筛选出的检测引物及实验体系可以较好的实现柑橘黄龙病菌的早期检测。

因此，基于分子生物学方法的PCR技术渐渐被应用于柑橘黄龙病的研究当中，为黄龙病菌的早期诊断及后期的及时防控提供了条件[14]。而本实验中引物灵敏度的提高能有效降低假阴性的情况，能够满足早期定性诊断的需要。在做PCR检测时，每组实验都至少重复2次，并设置阴性或者阳性对照，避免误差或者由于操作失误导致实验结果出现偏差。