鱼蛋白水解产物抗氧化活性

胡二坤，郭兴凤，郑慧

1. 河南职业技术学院烹饪食品与健康学院（郑州 450046）；2. 河南工业大学粮油食品学院（郑州 450001）

人体的新陈代谢会产生很多自由基，这些自由基会破坏生物分子的结构，改变其功能性质，最终导致细胞或组织损伤[1-2]。近年来，对天然活性物质的抗氧化能力的研究越来越多。天然活性物质的抗氧化活性评价的方法有很多，不同的方法有其特色和应用范围。目前，关于天然活性物质抗氧化能力的评价方法主要有DPPH·清除率、超氧阴离子（O2-·）自由基清除率、羟自由基（·OH）清除率、还原力、抑制脂质过氧化的能力等。

以鱼蛋白水解产物和3个分离组分作为研究对象，分别以DPPH·清除率、羟自由基（·OH）清除率和还原力为指标，评价鱼蛋白酶水解产物及3个分离组分的抗氧化活性。通过多指标的评价，系统地研究鱼蛋白水解产物的抗氧化活性。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

鱼蛋白水解产物和分离产物：实验室自制。采用碱性蛋白酶（酶活3.0×105U/mL），在底物浓度18.05%、加酶量2.40%、水解pH 8.07、水解温度48.84℃条件下进行酶水解，酶解液经真空浓缩、冷冻干燥后制成粉末，即为鱼蛋白水解产物。选用G-15葡聚糖凝胶作为柱材料分离纯化鱼蛋白水解产物，在上样质量浓度100 mg/mL、上样体积2 mL、蒸馏水洗脱、洗脱速度2.0 mL/min的条件下分离纯化鱼蛋白水解产物，得到3个分离组分：组分Ⅰ、组分Ⅱ和组分Ⅲ，3个分离组分的蛋白含量依次为83.70%，49.20%和36.91%，峰面积分别占51.70%，13.90%和34.40%。

DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

水杨酸、乙醇、三氯乙酸、氯化铁、铁氰化钾、硫酸亚铁、盐酸、抗坏血酸、过氧化氢、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、茚三酮等试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器与设备

RE-2000A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；LGJ-18型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；AY120型分析天平，日本岛津公司；722S可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；SHA-C型数显水浴恒温振荡器，金坛华峰仪器有限公司；SL型恒温水浴锅，上海树立仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DPPH·清除率的测定

参照Jamdar等[3]的方法并稍作修改。取2 mL水解液，加入2 mL新配制的浓度1×10-4mol/L的DPPH溶液，摇匀，室温避光条件下反应30 min，在517 nm处测定吸光度。空白试样为不加入样品或DPPH溶液，分别用等体积无水乙醇代替。清除率按式（1）计算。

式中：Al为样品组加入样品和DPPH溶液时的吸光度；A2为空白组加入样品，不加入DPPH溶液时的吸光度；A3为对照组不加样品，加入DPPH溶液时的吸光度。

1.3.2 还原力的测定

还原力的测定参照Oyaizu[4]的方法并适当修改，以普鲁士蓝的生成量为指标，将铁氰化钾还原为Fe2+，再利用Fe2+形成普鲁士蓝，在700 nm下测定普鲁士蓝的生成量。取2 mL鱼蛋白粉水解液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1%铁氰化钾后，在50 ℃条件下水浴反应20 min，取出，迅速冷却并加入2.5 mL 10%三氯乙酸终止反应。取2.5 mL上述混合液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁，充分混合后静置10 min，在700 nm下测定吸光度，同时以蒸馏水代替样品做空白试验。

1.3.3 羟自由基（·OH）清除率的测定

羟自由基清除率的测定方法基于水杨酸可以捕获羟自由基（·OH）生成2, 3-二羟基苯甲酸和2, 5-二羟基苯甲酸，在510 nm处有最大吸收建立的一种用分光光度计检测Fenton反应产生羟自由基的方法[5]。羟自由基（·OH）清除率的测定方法参照董银萍等[6]的方法并做适合修改。取2 mL鱼蛋白粉水解液，加入3 mL 1.8 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，4 mL 1.8 mmol/L的FeSO4，最后加入0.2 mL 0.2% H2O2溶液启动反应，在37 ℃水浴条件下反应30 min，在510 nm波长下测吸光度，同时做空白试验。·OH清除率按式（2）计算。

式中：A为样品组加入鱼蛋白粉水解液测得的吸光度；A0为空白组用蒸馏水代替鱼蛋白粉水解液测得的吸光度。

1.3.4 数据处理

试验采用GraphPad、Origin 8.5、SPSS 16.0等软件对所得相关数据进行统计分析。所有试验至少重复三次，结果取三次试验的平均值。

2 结果与讨论

2.1 鱼蛋白水解产物及分离组分的DPPH·清除能力研究试验结果

由图1可以看出，鱼蛋白水解产物和3个分离组分的DPPH·清除能力均随着浓度的增大而增强。从图1（a）中可以看出，在1.0～7.5 mg/mL时，随着鱼蛋白水解产物浓度的增加，其DPPH·清除率呈现显著性增加（p＜0.05），当鱼蛋白水解产物质量浓度为2 mg/mL时，DPPH·清除率达到47.0%。由图1（b）可见，组分Ⅰ在质量浓度为0.8～5.0 mg/mL时，其DPPH·清除率呈现显著性增加，质量浓度为1.6 mg/mL时，组分Ⅰ的DPPH·清除率为51.1%。组分Ⅱ的DPPH·清除能力由图1（c）所示，在0.5～8.0 mg/mL质量浓度范围内，组分Ⅱ的DPPH·清除率显著性增强，当质量浓度为2.0 mg/mL时，组分Ⅱ的DPPH·清除率为33.6%。组分Ⅲ的DPPH·清除率在0.4～4.0 mg/mL质量浓度范围内显著增加，当组分Ⅲ质量浓度为2.0 mg/mL时，其DPPH·清除率59.7%。

图1 鱼蛋白水解产物及分离组分质量浓度对DPPH·清除能力的影响

2.2 鱼蛋白水解产物及分离组分还原能力研究试验结果

由图2可以看出，鱼蛋白水解产物和3个分离组分的还原能力均随着浓度的增加呈显著性增加。由图2（a）可见，鱼蛋白水解产物在0.7～7.8 mg/mL浓度范围内，还原力呈现显著性增加，当鱼蛋白水解产物质量浓度为4.3 mg/mL时，其还原力为0.450。图2（b）为组分Ⅰ的还原能力随浓度的变化趋势，可以看出，在0.8～12.6 mg/mL质量浓度范围内，还原力呈现显著性增加，当组分Ⅰ质量浓度为6.7 mg/mL时，其还原力为0.442。图2（c）为组分Ⅱ的还原能力曲线图，在1.0～14.8 mg/mL时，组分Ⅱ的还原力随着质量浓度的增大显著性增加，当质量度浓度7.9 mg/mL时，其还原力为0.439。由图2（d）可见，随着组分Ⅲ在0.4～3.7mg/mL质量浓度范围内增加，还原力呈现显著性增加，当组分Ⅲ质量浓度为1.9 mg/mL时，其还原力为0.441。

图2 鱼蛋白水解产物及分离组分质量浓度对还原力的影响

2.3 鱼蛋白水解产物及分离组分·OH清除能力试验结果

由图3可以看出，鱼蛋白水解产物和3个分离组分的·OH清除能力均随着浓度的增加呈现显著性增加。由图3（a）可见，鱼蛋白水解产物在0.4～2.0 mg/mL浓度范围内，·OH清除能力呈现显著性增加，当鱼蛋白水解产物质量浓度为0.7 mg/mL时，其·OH清除率为56.3%。图3（b）为组分Ⅰ的·OH清除能力随浓度的变化趋势，可以看出，在0.8～8.4 mg/mL浓度范围内，·OH清除能力呈现显著性增加，当组分Ⅰ质量浓度为4.2 mg/mL时，其·OH清除能力为81.4%。图3（c）为组分Ⅱ的·OH清除能力曲线图，在0.01～2.00 mg/mL时，组分Ⅱ的·OH清除能力随着浓度的增大显著性增加，当质量浓度为0.3 mg/mL时，其·OH清除能力为67.0%。由图3（d）可见，随着组分Ⅲ在0.4～3.7 mg/mL质量浓度范围内增加，·OH清除能力呈现显著性增加，当组分Ⅲ质量浓度为1.5 mg/mL时，其·OH清除能力为69.4%。

图3 鱼蛋白水解产物及分离组分质量浓度对·OH清除能力的影响

2.4 鱼蛋白酶水解产物及其分离纯化组分IC50值比较研究试验结果

分别对鱼蛋白水解产物及分离组分Ⅰ、组分Ⅱ和组分Ⅲ进行IC50的测定，结果见表1。

由表1分析出，鱼蛋白水解产物经过分离纯化，部分组分的抗氧化能力得到提高。其中组分Ⅰ的DPPH·清除能力得到提高，组分Ⅱ的·OH清除能力得到提高，组分Ⅲ的DPPH·清除能力和还原能力都得到了提高。组分Ⅲ的DPPH·清除能力和还原能力最强，其DPPH·清除能力的IC50值为1.43 mg/mL；还原力在吸光度为0.5时，质量浓度为1.88 mg/mL。组分Ⅱ的·OH清除能力最强，IC50值为0.30 mg/mL。

表1 水解产物和分离组分的抗氧化能力测定结果单位：mg/mL

由于Fenton反应生成·OH需要亚铁离子的参与，鱼蛋白和3个分离组分对·OH的清除作用可能是由于一方面酶解物与亚铁离子结合，抑制了自由基的产生；另一方面是对已产生的羟自由基清除[7]。鱼蛋白水解产物对DPPH·清除作用是由于其可以向DPPH·提供电子或氢供体的疏水氨基酸暴露，使得鱼蛋白水解产物具有清除DPPH·的能力[7]。鱼蛋白水解产物提供电子或氢原子给自由基后，自身成为自由基中间体，中间体达到稳定态的时间和稳定态的稳定程度直接影响最终的自由基清除能力。因此，可以认为鱼蛋白酶解物中小分子的肽段对清除自由基起了关键作用，这与庄永亮等[8]、Ko等[9]的结果一致。

3 结论

鱼蛋白水解产物经过分离纯化后，部分组分的抗氧化能力发生了变化。其中组分Ⅰ和组分Ⅲ的DPPH·清除能力、组分Ⅱ的·OH清除能力和组分Ⅲ的还原能力均增强。研究发现，3个组分中，组分Ⅲ的DPPH·清除能力和还原能力最强，其DPPH·清除能力的IC50值为1.43 mg/mL；还原力在吸光度为0.5时，质量浓度为1.88 mg/mL。组分Ⅱ的·OH清除能力最强，IC50值为0.30 mg/mL。