耐铅植物内生菌的筛选及其促生机制研究

王红珠，吴华芬，吕高卿，赵云磊，黄立斌，余敏豪，黄长江*

(1.温州医科大学，浙江 温州 325000； 2.丽水市农林科学研究院，浙江 丽水 323000； 3.丽水市生产力促进中心，浙江 丽水 323000； 4.丽水学院，浙江 丽水 323000)

由于矿产资源的大量开发利用，各种化学农药及化肥的广泛使用，含重金属的污染物通过各种途径进入土壤，造成土壤重金属污染日益严重。目前，植物修复技术因其与环境生态相协调等优势，在治理重金属污染方面具有巨大的应用前景[1-2]。该技术对重金属富集植物的要求较高，大部分富集植物因适生范围窄、根系扩展深度有限、植株整体生长缓慢等缺陷导致修复污染土壤所需要的时间漫长[3]。大量研究表明，植物内生菌具有促进植物生长、降低重金属胁迫毒害植物等作用，在植物修复领域具有较好的应用潜力。张凯晔等[4]从田菁种子分离纯化得到一株BacillusSC60内生菌，并证明该菌可分泌IAA、溶解无机磷、提高种子活力、促进胚根发育。Li等[5]从高粱根中发现内生细菌K3-2(Enterobactersp.)，能产ACC脱氨酶、IAA、铁载体和精氨酸脱羧酶。盆栽试验表明，菌株K3-2显著提高了在铜矿废弃地生长的苏丹红高粱的干重和根系铜积累量。

近年来，关于耐重金属内生菌的研究主要集中在菌株的分离鉴定、促生特性检测等方面，但关于产促生物质影响因素的研究却鲜有报道。本试验以重金属超富集植物为材料，从中分离筛选出耐重金属优势内生菌，研究其促生特性及影响因素，并模拟重金属污染环境，考察其实际促生效果，为内生菌植物联合修复重金属污染的研究提供理论依据，以推动内生菌在植物修复重金属污染土壤工程中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

钻叶紫苑、野茼蒿、牛筋草、博落回采集于丽水市水阁村重金属污染较为严重的地区，大豆种子由丽水市农科院提供。

冷冻高速离心机(SIGMA Laborzentrifugen GmbH，3 K 15)，紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司，UV-4802)，原子吸收分光光度计(岛津，AA-6300C)等。高氏一号培养基；LB液体培养基；PKO液体培养基；SA液体培养基等。

1.2 耐重金属内生菌的初筛

将外表面消毒的植物组织碾磨并分别置于牛肉膏蛋白胨、马丁氏和高氏等液体培养基中富集培养。吸取0.1 mL富集液涂布于含不同Pb2+浓度的上述3种培养基上，于30 ℃培养3～6 d后，挑取抗性优势菌，纯化后4 ℃保存。培养基Pb2+浓度分别为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 mg·L-1。

1.3 耐重金属内生菌的复筛

将初筛获得的菌株接种到PKO平板、LB液体培养基(含100 mg·L-1色氨酸)和CAS平板上，28 ℃培养。每天观察PKO培养基上溶磷圈的大小，判断溶磷效果。用比色法检测LB液体培养基，确定产IAA能力。以CAS平板上橙黄色透明圈大小确定产铁载体能力。根据溶磷性、IAA与铁载体的定性测定，筛选出优势菌株。对筛选出的优势菌株进行产ACC脱氨酶定性检测[6]。

1.4 优势抗性菌株的鉴定

观察优势抗性菌株的菌落形态、革兰氏染色和芽孢染色结果，依据伯杰氏细菌鉴定手册，鉴定其种属。

1.5 优势抗性菌株促生效果影响因素研究

各取1.5 mL菌悬液分别接种于15 mL LB、PKO、SA液体培养基中，于140 r·min-1、28 ℃培养72 h后测其IAA、可溶性磷和铁载体含量。以单因素试验考察初始接种量、Pb2+浓度和培养时间对优势抗性菌株促生效果的影响。各因素水平设置如下：培养时间为1～8 d，重金属Pb2+浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700 mg·L-1，产IAA试验的接种量分别为2、3、4、5、6%，可溶性磷和产铁载体试验的接种量分别为4、7、10、13、16%。IAA定量检测采用比色法，磷含量定量检测参考陈超琼[7]的方法，铁载体定量检测参考雷平[8]的方法。

1.6 优势抗性菌株对大豆生长及其重金属积累影响

试验组用优势抗性菌株侵染大豆种子，对照组用无菌水做相同处理，土培介质用含Pb2+的霍格兰氏营养液处理，添加的Pb2+浓度为800 mg·kg-1。培养30 d后，测定大豆植株的生长参数，并用火焰法测定大豆植株的重金属含量。

1.7 统计学处理

本试验数据以均数表示。两样本之间的比较用t检验，多样本之间的比较使用单因素或双因素方差分析，数据统计分析作图使用GraphPad Prism 7.0软件。

2 结果与分析

2.1 耐重金属内生菌的筛选与鉴定

本试验从钻叶紫苑等4种植物中共筛选出24株具有重金属抗性的内生菌，其中3株为内生真菌，其余21株均为内生细菌，最高Pb2+耐受浓度为1 000 mg·L-1。对初筛分离的耐重金属内生菌进行促生效果鉴定，结果表明，初筛分离出的24株耐重金属内生菌中，13株能产IAA，17株能产铁载体，6株具有溶磷效果。其中4株内生菌同时具备这3种能力，分别为MZ01、GZ01、GZ02、GY01菌株。菌株GZ01的IAA检测变色最明显，铁载体变色圈和溶磷圈较大，分别为1.10和1.14 mm，且具有产ACC脱氨酶能力，能利用ACC为唯一氮源进行生长。因此，选定该菌株为后续试验菌种。

耐重金属内生菌GZ01菌落平展，近圆形，中央隆起，白色，有光泽，不透明，边缘光滑(图1)。该菌为革兰氏阳性球菌(图2)，2～4个菌连成链状，不产芽孢(图3)。依据伯杰氏细菌鉴定手册判断该菌为链球菌属。

图1 菌落形态

图2 革兰氏染色结果

图3 芽孢染色情况

2.2 菌株GZ01促生效果的影响因素

2.2.1 初始接种量

不同接种量对菌株GZ01产IAA具有显著影响，对溶磷效果和产铁载体具有极显著影响。接种量在2～3%时IAA含量逐渐上升，在3%～6%时IAA含量逐渐降低，IAA含量在接种量为3%时最高，为23.47 μg·mL-1(图4)。铁载体活性与磷含量均随着接种量的增加先上升后下降，同时在接种量为10%时最高，分别为35.84%和8.80 μg·mL-1(图5～6)。因初始接种量对代谢产物的合成有较大的影响，接种量小，延迟期较长，使繁殖时间延长，营养物质耗损过多，导致目的产物产量不高；接种量过大时，菌体迅速生长，溶氧量急剧减小，从而降低次级代谢产物的合成，故在最适接种量下，内生菌各产物产量最高。因此，内生菌GZ01产IAA的最适接种量为3%，溶磷效果与产铁载体的最佳接种量均为10%。

图4 接种量对菌株GZ01产IAA的影响

图5 接种量对菌株GZ01产铁载体的影响

图6 接种量对菌株GZ01产可溶性磷的影响

2.2.2 重金属Pb2+浓度

不同Pb2+浓度对菌株GZ01产IAA具有极显著影响，对产铁载体具有显著影响。随Pb2+浓度的增加，IAA含量增高，在500 mg·L-1时达到最大，之后Pb2+浓度增加，IAA含量趋于稳定(图7)。表明内生菌产IAA的能力受Pb2+浓度诱导，且该诱导效果在Pb2+浓度为500 mg·L-1时达到最强。铁载体活性单位随Pb2+浓度的增加而增加，在Pb2+浓度为100～200 mg·L-1时活性稳定且保持较高，在Pb2+浓度超过200 mg·L-1后，活性下降，在浓度为200～400 mg·L-1，下降尤为明显。在Pb2+浓度超过400 mg·L-1后，活性单位变化不明显，但仍高于30%(图8)。表明该菌产铁载体能力受Pb2+诱导，在Pb2+浓度为200 mg·L-1时，该能力达到最强。过高Pb2+浓度刺激(Pb2+>200 mg·L-1)会抑制铁载体的分泌，但即使在高浓度Pb2+下，GZ01仍可以产生活性较高的铁载体(活性>30%)。由于重金属铅对可溶性磷化合物有很强的吸附性，能形成难溶性的磷酸化合物，影响试验结果。因此，本试验未涉及Pb2+浓度对可溶性磷含量的影响。

图7 Pb2+浓度对菌株GZ01产IAA的影响

图8 Pb2+浓度对菌株GZ01产铁载体的影响

2.2.3 培养时间

不同培养时间对菌株GZ01溶磷、产IAA和铁载体的能力具有极显著影响。1～5 d，IAA含量上升，5～8 d，IAA含量降低，IAA含量在5 d达到最高值，为34.17 μg·mL-1(图9)。因此，内生菌GZ01合成IAA最适培养时间为5 d。1～6 d培养液中铁载体含量逐渐升高，在6 d达到顶峰，为88.41%。6 d之后铁载体活性下降(图10)。可知内生菌GZ01产铁载体最佳的培养时间为6 d。可溶性磷含量随着时间的变化先升高后降低，在6 d达到最高峰，为35.41 μg·mL-1，此时溶液中大量难溶性磷转化成可溶性磷，故溶磷效果最佳为6 d(图11)。

图9 培养时间对菌株GZ01产IAA的影响

图10 培养时间对菌株GZ01产铁载体的影响

图11 培养时间对菌株GZ01产可溶性磷的影响

2.3 菌株GZ01对大豆生长及其重金属积累的影响

模拟培养结果表明，接种GZ01的大豆植株在株高、茎叶鲜重、茎叶干重和Pb2+含量4个指标与对照组有极显著差异(表1)。在添加Pb2+浓度为800 mg·kg-1的条件下，对照组植株体内Pb2+浓度为0.32 mg·g-1，染菌组植株体内Pb2+浓度为0.25 mg·g-1，比对照组低21.88%。且该处理条件下，染菌组的株高、茎叶鲜重、茎叶干重、根鲜重和根干重分别比对照组增加了137.44%、135.14%、83.33%、15.00%、78.57%。可见，即使在高Pb2+浓度环境下，菌株GZ01仍对大豆的生长有明显促进作用。推测该菌可能通过分泌IAA，产铁载体等途径,降低Pb2+对宿主植物的毒害使幼苗长势良好。

表1 接种菌株GZ01后大豆生长参数的变化

3 讨论

植物修复土壤重金属污染以其高效、低廉、生态友好、无二次污染等优势被认为是最有前景的修复技术。但该技术存在修复植物生长缓慢，低生物量等问题。如Hammer等[9]通过田间试验发现，利用Thlaspicaerulescens修复土壤Cd2+需10 a时间。McGrath等[10]通过田间试验结果发现，由于修复植物A.halleri的生物量较低，对Cd2+的吸收能力不强，导致其修复Cd2+污染效率低下。而植物修复土壤重金属污染的关键在于提高富集植物的生物量[11]。故如何促进超富集重金属植物的生长及生物量的增长是目前植物修复重金属污染的重点。

本试验在重金属污染严重的地区采集植物样本，从样本中筛选得到1株耐铅性较强的内生菌GZ01，经鉴定为链球菌属(Streptococcus)。该菌最高可耐受700 mg·L-1Pb2+，且具有溶磷效果，产IAA、铁载体和ACC脱氨酶等促生物质。各单因素试验结果表明，菌株GZ01的各项促生特性受时间、Pb2+浓度和初始接种量等因素的影响。在初始接种量为3%、Pb2+浓度为500 mg·L-1条件下，培养5 d，该菌分泌IAA效果最好。在初始接种量为10%，培养6 d，该菌溶磷效果最好。在初始接种量为10%、Pb2+浓度为200 mg·L-1的条件下，培养6 d，该菌产铁载体效果最好。刘丽辉等[12]研究表明，南方野生稻内生细菌JH50产IAA能力为29.97 mg·L-1。王维[13]的研究表明，内生菌分泌IAA随时间变化先增加后骤然降低。田方等[14]从烟草根际分离出的G-229-21T可产铁载体活性最高为82.30%，而本试验中菌株GZ01的铁载体活性最高可达到88.41%，比G-229-21T高6.11%，说明内生菌GZ01具有很强的促生优势。

在模拟重金属污染的条件下，菌株GZ01能降低宿主植物体内Pb2+浓度，对大豆植株的生长及生物量的积累起促进作用。促生效果影响试验结果表明，菌株GZ01即使在高Pb2+浓度环境中，仍具有较强的产IAA和铁载体的能力。说明该菌可能通过分泌IAA，产铁载体等方式，调节植物生命活动，降低Pb2+对宿主植物的毒害。Babu等[15]从樟子松的根中分离得到了GSB-1菌株(Bacillusthuringiensis)。该菌株可产ACC脱氨酶、IAA和铁载体等，并且增加了冷杉幼苗的生物量、叶绿素含量，提升了对含重金属尾矿土壤的植物修复效果。万勇[16]将镉超富集植物龙葵内生菌DE5(Variovoraxparadoxu)接种于青葙，发现与未接种的空白对照组相比，青葙根部生物量增加了125.0%，对镉的富集能力增强了81%。本文的结论与Babu等观点一致，在添加Pb2+浓度为800 mg·kg-1的条件下，染菌组植株的茎叶干重和根干重分别比对照组提高83.33%和78.57%，表明菌株GZ01即使在高浓度的重金属污染环境下，仍可大幅度提高宿主植物的生物量，为弥补植物修复的不足提供新的参考。

综上所述，耐重金属内生菌GZ01具有产IAA、铁载体、溶磷等多项促生能力，在重金属污染的环境中能促进宿主植物生长及生物量的增加，提高植物修复重金属污染效率，可将其作为工程菌进行诱导，联合植物共同修复重金属污染。耐重金属内生菌GZ01在植物体内的生命活动规律，以及在重金属存在条件下与植物的协同作用机理及原位修复应用的实际效果有待进一步研究。