姜烯酚6衍生物M14通过调控Keap1/Nrf2信号通路诱导人结直肠癌HCT-8细胞凋亡

杨 春，李 恒，董欣宇，谢小亮，张 东

（宁夏医科大学总医院结直肠外科，银川 750004）

全球癌症报告[1]数据显示，2018年全球癌症新发病例1810万，死亡病例960万。全球范围内结直肠癌的发病率仅次于肺癌和乳腺癌位列第三位，结肠直肠癌的病死率仅次于肺癌位列第二位。目前临床使用的治疗结直肠癌药物大多数为基因工程重组单克隆抗体靶向药物[2]，价格昂贵，给家庭和社会带来了极大的负担，因此开发高效且经济的小分子治疗药物成为国内外研究的重点。

生姜作为一种佐料、膳食补充剂及中药在世界范围内已经广泛使用，其主要的活性成分是姜辣素和姜烯酚[3]。姜烯酚6（Gingerol6，S6）为干姜的主要成分，研究[4]显示其具有抗炎、镇痛、解热、抗氧化和抗癌的特性。Keap1/Nrf2（Kelchlike ECHassociatedprotein1/nuclearfactorE2related factor2）信号通路是机体一个非常重要的对癌症自身防御抵抗信号通路，也是近年来抗癌研究的一大热点。S6可能通过Keap1/Nrf2信号通路起到抑制肿瘤的作用[5]。S6衍生物M14（Gingerol derivativeM14，S6-M14）较S6具有更强的抑制结肠癌生长的作用[6]。目前S6-M14预防结肠癌发生的作用机制尚未见报道。本研究以人结直肠癌HCT-8细胞为研究对象，通过观察不同浓度的S6-M14对其增殖、凋亡和信号通路蛋白表达的影响，以期为探索其抑制结肠癌细胞生长的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与药物

人结直肠癌HCT-8细胞购于美国ATCC CLS号为300210。S6-M14购于中国武汉天植生物技术有限公司，CAS号为555-66-8。

1.2 试剂与设备

3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基四氮唑溴盐［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5 diphenyltetrazoliumbromide，MTT］、L-谷氨酰胺DMSO购于美国Sigma-Aldrich公司；DMEM-F1培养液、底透白边96孔板、96孔板、6孔板购于美国CORNING公司；胰蛋白酶、PBS缓冲液购于美国Hyclone公司；FBS购于美国GIBCO公司CellTiter-GloRLuminescentCellapoptosisAssa购于美国Progema公司；核蛋白提取试剂盒购于美国THERMO公司；细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购于武汉优尔生商贸有限公司；Keap1Nrf2、β-肌动蛋白、LaminB兔抗人抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购于美国Cell SignalingTechnology公司；免疫印迹化学发光试剂盒购于中国上海锐赛生物技术有限公司；恒温CO2培养箱购于日本SANYO公司；生化分析仪购于美国NOVA公司；多功能微孔检测仪购于美国PerkinElmer公司；台式低温离心机购于美国BECKMAN公司；稳压稳流电泳仪、MiniTransblot转移系统购于美国Bio-Rad公司；Image－QuantLAS4000mini图像分析系统购于美国GE公司。

1.3 人结直肠癌HCT-8细胞的培养

复苏人结直肠癌HCT-8细胞，接种于DMEMF12+5%FBS+2mol·L-1L-谷氨酰胺的培养基中，于37℃、5%的CO2细胞培养箱培养。每天取少许细胞于NOVA生化分析仪测定细胞密度和活率，做细胞生长曲线，取对数生长期的细胞进行后续试验。

1.4 MTT法检测S6-M14对人结直肠癌HCT-8细胞增殖的影响

取对数生长期人结直肠癌HCT-8细胞，用含5%FBS的DMEM-F12培养液将细胞密度调整为5×104细胞/mL，加入96孔细胞培养板，每孔100μL，则细胞接种量为5×103细胞/孔。将96孔板置于5%CO2培养箱中37℃培养24h。加入S6-M14，使人结直肠癌HCT-8细胞分别处于0.25mmol·L-1、0.5mmol·L-1、1mmol·L-1、2mmol·L-1和4mmol·L-1终浓度的S6-M14刺激中，空白组含0mmol·L-1的S6-M14，每个浓度重复3个复孔，刺激时间均为24h，每孔加入MTT至终浓度为5mg·mL-1继续培养4h。弃去孔中的培养基和MTT，每孔加入150μL的DMSO，室温振荡10min，使结晶物充分溶解，用多功能微孔检测仪检测490nm波长处各孔吸光度（A）值。

1.5 ATP显色法检测S6-M14诱导人结直肠癌HCT-8细胞凋亡

取对数生长期的人结直肠癌HCT-8细胞于25℃，300×g离心5min；用IMEM-F12培养基调整细胞密度至8×105个/mL，接种至96孔板，50μL/孔；用IMEM-F12培养基稀释S6-M14至160mmol·L-1，再以IMEM-F12培养基进行1∶2稀释，共设12个梯度，每个稀释度设3个复孔；将稀释好的S6-M14加至96孔板，50μL/孔。置37℃，5%CO2培养箱静置24h；于25℃室温中将CellTiter-GloRLuminescentCellapoptosisAssay试剂盒中的缓冲液融化，1瓶缓冲液溶解1瓶酶粉，配成测定工作液，于各孔中加入100μL，酶标仪振动2min，25℃室温避光静置10min；用PerkinElmer多功能微孔板检测仪在超灵敏化学发光模式下测定化学发光值。以S6-M14的反应终浓度为横坐标，以PerkinElmer多功能微孔板检测仪测定的化学发光值为纵坐标，将数据整理输入GraphPadPrism软件中。对横坐标进行对数转换，在非线性拟合功能下，选择Sigmodialdose response（variablescope）拟合四参数曲线。

1.6 Westernblot检测Keap1/Nrf2信号通路蛋白的表达

取对数生长期的人结直肠癌HCT-8细胞于25℃，300×g离心5min；用IMEM-F12培养基调整细胞密度至1×106/mL，将细胞吹打均匀后加入6孔细胞培养板，每孔加2mL，则接种量为2×106细胞/孔，置于5%CO2的恒温培养箱中培养24h。加入不同浓度的S6-M14，使人结直肠癌HCT-8细胞分别处于0.25、1和4mmol·L-1终浓度的S6-M14刺激中，空白组不含S6-M14，每个浓度重复3个复孔，刺激时间均为24h。提取各组细胞的细胞质与细胞核蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE分离蛋白，电转至PVDF膜，将膜置于5%脱脂牛奶中室温封闭1h，洗涤3次后分别加入稀释好的Keap1、Nrf2（均为1∶2000稀释）、β-actin兔抗人一抗（1∶3000稀释），室温孵育2h。洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5000稀释），室温孵育2h。洗涤3次后ECL免疫印迹显色试剂进行显色，分析胞质蛋白中Keap1、Nrf2相对于β-肌动蛋白的表达量及核蛋白中Nrf2相对于LaminB的表达量。

1.7 统计学方法

数据使用GraphPadPrism5.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人结直肠癌HCT-8细胞生长曲线

人结直肠癌HCT-8细胞经复苏培养后，潜伏期为0～24h；36h细胞开始增殖，48～72h增殖明显，呈指数增长；84h后细胞增殖趋缓，呈平台期；108h后细胞增长进入停滞期，呈下降趋势，见图1。依据人结直肠癌HCT-8细胞生长曲线，选择复苏后48～72h指数生长期的人结直肠癌HCT-8细胞进行试验。

图1 人结直肠癌HCT-8细胞生长曲线

2.2 S6-M14对人结直肠癌HCT-8细胞增殖的影响

与空白组相比，0.25、0.5、1、2、4mmol·L-1S6-M14均可抑制人结直肠癌HCT-8细胞的活性（P均＜0.001），提示S6-M14可抑制人结直肠癌HCT-8细胞的增殖，见图2。

图2 S6-M14对人结直肠癌HCT-8细胞活性的影响

2.3 姜烯酚6衍生物M14促进人结直肠癌HCT-8细胞凋亡作用

S6-M14促进人结直肠癌HCT-8细胞凋亡作用符合四参数方程y=（A-D）/［1+（X/C）B］+D，其中A=2.376×106，B=-1.349，C=1.186，D=5.811×106，在半对数坐标上呈典型的S曲线，R2为0.9893，四参数曲线见图3。提示S6-M14可剂量依赖性地促进人结直肠癌HCT-8细胞的凋亡。

图3 姜烯酚6衍生物M14促进人结直肠癌HCT-8细胞凋亡作用

2.4 S6-M14对胞质内Keap1和Nrf2蛋白表达的影响

与空白组相比，0.25、1、4mmol·L-1的S6-M14均可抑制人结直肠癌HCT-8细胞Keap1/Nrf2信号通路Keap1和Nrf2蛋白的表达（P均＜0.01），见图4。

2.5 S6-M14对细胞核内Nrf2蛋白表达的影响

与空白组相比，0.25、1、4mmol·L-1的S6-M14均可促进细胞核内Nrf2的表达（P均＜0.05），提示S6-M14促进人结直肠癌HCT-8细胞Nrf2核移位，见图5。

图4 S6-M14对Keap1/Nrf2信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

结直肠癌的发生、发展过程非常复杂，与众多因素相关。近几十年来，流行病学调查和分子、细胞生物学研究都表明，饮食是影响结直肠癌发病率的最重要因素[7]。生姜是我国常用的一种佐料，多项研究显示干姜的主要成分S6具有抗氧化和抗癌作用，S6-M14较S6具有更强的抗癌作用，且毒性较姜烯酚6低[8-9]。

图5 S6-M14对Nrf2核移位的影响

本研究结果显示，S6-M14对人结直肠癌HCT-8细胞的增殖具有抑制作用，剂量依赖性地诱导人结直肠癌HCT-8细胞凋亡，下调了人结直肠癌HCT-8细胞胞质内Keap1和Nrf2蛋白的表达，并且促进了Nrf2蛋白的核移位。推测S6-M14可能与胞质内的Keap1反应，导致Keap1蛋白构象的变化，Nrf2与之解离并进入细胞核，与ARE结合激活启动下游多种保护性基因的表达[10-11]，从而促进了人结直肠癌HCT-8细胞凋亡。

综上所述，S6-M14通过调控Keap1/Nrf2信号通路，抑制人结直肠癌HCT-8细胞增殖、诱导细胞凋亡。因此，S6-M14在肿瘤治疗方面具有一定的应用前景。