生物炭对小麦根际和根内微生物群落结构的影响

徐民民，黄 莹，李 波，徐 艳，张 帅，姚岭芸，王 政

(1.山东省环境保护科学研究设计院有限公司，山东 济南 250100； 2.青岛大学 环境科学与工程学院，山东 青岛 266071)

近年来，利用生物炭改善土壤条件和肥力的措施受到了国内外的广泛关注。生物炭是指生物质，如农作物废弃物，在限氧或缺氧的条件下高温裂解后得到的一种稳定的芳香化富碳有机产物[1-2]。由于含有较发达的孔隙结构、丰富的含氧基团，以及矿物成分等，生物炭被广泛地应用于土壤改良和作物增产等方面。生物炭一般呈碱性，可以用作酸性土壤的改良剂来中和土壤的酸度[3]，从而提高土壤的pH值。生物炭的高芳香化表面、孔隙结构、强吸附能力可以为土壤微生物提供生存繁殖的场所和营养物质[4]。同时，生物炭添加可间接或直接影响土壤微生物的种群多样性和生长代谢过程，改善根际生长环境和根系对营养元素的吸收状况，从而进一步影响植物的生长发育。

根际是指受到植物根系生长影响的土壤微域，是植物、土壤和微生物相互作用的活跃的微生态界面[5]。其中，根际微生物是植物根系的重要组成部分，被誉为植物的第二套基因组[6]，在植物的生长代谢过程中起着非常重要的作用。植物通过根系向周围土壤分泌大量的有机物质，吸引特定的微生物在其根系周围定殖，并且有部分微生物可以穿过根系细胞壁进入植物根系内部，形成根内微生物。植物根际微生物可以通过将土壤中植物生长所必需的营养元素转变成植物较易吸收的形态、抵御病原菌侵害、产生植物激素等途径促进植物生长，帮助植物抵御高温、高盐环境等的胁迫[7-9]。植物根际微生物的结构组成受多种因素调节和影响。土壤类型、植物类型、外界环境、耕作条件和管理方式等都对植物根际微生物的群落结构组成具有明显影响[10-11]。

相关研究表明，生物炭能够改变土壤根际环境中微生物的群落多样性，使之呈现出或增加，或不变，或降低的趋势[12]。Graber等[13]的研究发现，增加生物炭的施用量显著提高了根际土壤细菌种类的多样性和分布的均匀程度；但邵慧芸等[14]研究生物炭对烤烟生长的影响时却发现，生物炭添加后，土壤根际细菌和真菌的多样性和丰富度均显著降低。从以上结果推测，生物炭对根际土壤微生物群落的影响可能受到多种因素的调控，包括生物炭原材料、制备过程、作物品种和土壤类型等。生物炭的添加能够改变根际微生物群落的结构组成，促进或者抑制特定功能微生物的生长。顾美英等[15]的研究表明，生物炭的施用对灰漠土根际和非根际土壤纤维素分解菌和自生固氮菌数量有提升作用，但对亚硝化细菌的数量有所抑制。不同微生物种类对生物炭的响应不同，且不同生物炭材料对微生物的影响也不同；因而，向土壤中添加不同的生物炭后，会呈现出不同的土壤根际微生物群落结构。明确生物炭对根际微生物结构组成的影响，对于改善土壤根际环境、促进作物生长等具有积极的意义。

小麦是我国主要的粮食作物之一，是农业经济发展中必不可少的一大支柱。本研究以稻壳热解生物炭为材料，以小麦作为研究对象，通过高通量测序技术研究生物炭施用对小麦根际分区，特别是根际微生物结构组成的影响，以期揭示生物炭对小麦根际微生物群落组成的影响，为今后利用生物炭调控作物生长提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料及其基本理化性状测定

供试土壤为棕壤土，系采自山东省青岛市农田0～20 cm的表层土壤。土样采集后保存于塑封袋中带回实验室，避光处风干后过2 mm筛。

供试土壤的基本理化性质测定方法简述如下。土壤与去离子水以1∶2.5的质量体积比混合，采用PHS-3C型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)测定pH值。称取0.1 g左右风干土样，经酸化处理后，采用Aurora 1030W型总有机碳分析仪(美国OI公司)测定土壤有机质含量。称取10 g新鲜土样加入40 g去离子水，恒温振荡(200 r·min-1)0.5 h后离心过膜，采用Multi N/C 3100总有机碳/总氮分析仪(德国Jena公司)测定浸提液，测算土壤中的可溶性有机碳(DOC)和可溶性有机氮(DON)含量。速效磷的测定利用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法。速效钾的测定采用NH4OAc浸提-火焰光度法。

经测定，土壤的基本理化性质如下：pH值6.01，有机质含量8.35 g·kg-1，DOC含量0.56 g·kg-1，DON含量36 mg·kg-1，速效磷含量18.9 mg·kg-1，速效钾含量155.6 mg·kg-1。

供试小麦(TriticumaestivumL.)品种为济麦22，购于山东鲁研农业良种有限公司。

参照文献[16]制备生物炭，简述如下：选取稻壳作为制备生物炭的原材料，将稻壳置于可控温的马弗炉进行无氧热解，热解温度以25 ℃·min-1的速率逐步升高至600 ℃并保持2 h，冷却至室温后取出。所得生物炭过0.15 mm筛后保存于干燥器中。

利用TriStarII 3020型比表面积分析仪(美国Micromeritic公司)测定生物炭的比表面积(BET)、孔隙体积和孔径。生物炭与去离子水以1∶10的质量体积比混合，之后采用PHS-3C 型pH计测定pH值。称取1 g生物炭平铺于陶瓷坩埚底部，敞口置于马弗炉内，750 ℃灰化6 h，冷却后称重，计算灰分含量。利用vario MICRO cube型CHN元素分析仪(德国Elementar)测定生物炭的C、H、O、N含量。

经测定，所制生物炭的理化性质如下：pH值10.49，灰分31.3%，BET 64.9 m2·g-1，孔隙体积0.04 cm2·g-1，孔径9.52 Å，元素组成包括C 46.8%、N 1.67%、H 1.77%、O 28.78%。

1.2 小麦盆栽培养

开展盆栽培养试验。塑料盆尺寸为直径5 cm，高10 cm。试验共设置加生物炭和不加生物炭的2类处理，每类处理内均同时设置未种植小麦的处理作为空白土壤对照，每个处理设置3个重复。加生物炭的处理中，称取6 g生物炭添加至144 g供试土壤中(生物炭添加比例4%)，混合均匀。各处理下，每盆均装入供试土壤(含生物炭)150 g，与基肥[CH4N2O(分析纯)48 mg、KH2PO4(分析纯)99 mg、KCl(分析纯)43.5 mg]混合均匀后装盆。小麦种子经10%(体积分数)H2O2表面消毒1 min，之后用去离子水彻底洗净。选择饱满、大小均匀一致的种子播撒于塑料盆中(每盆2～3粒)。每天适当补充去离子水，使土壤保持60%的田间持水量。当种子出苗稳定后，每盆保留生长状况一致的小麦幼苗2株，培养至47 d后分别采集小麦根系和根际土壤。

根际土壤和小麦根系的采集步骤主要参考Edwards等[17]对水稻根际微生物的采样过程进行，具体包括：将小麦根系手动摇晃至约1 mm土壤附着于其表面后，将小麦根系放于灭菌的去离子水中涡旋振荡，将附着于根表的土壤清洗至去离子水中，这部分土样即为根际土壤；继续涡旋超声清洗小麦根系表面土壤颗粒附着，保留小麦根系。将小麦根系、根际土壤和空白土壤于-20 ℃保存，用于后续样品DNA的提取。

1.3 DNA提取和高通量测序

采用FastDNA Spin Kit for Soil(美国MP Biomedicals LLC)试剂盒分别对根际、空白土壤(新鲜土样0.25 g)和小麦根系(新鲜样品0.1 g)样品进行DNA提取[18]。采用PCR反应体系对16S rRNA基因的V3～V4区域进行扩增，引物为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[19]。同时，为了区分不同的样品，在515F前端加入不同的barcode序列。PCR反应条件如下：98 ℃预变性30 s；然后98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27个循环；最后72 ℃延伸5 min。扩增后的DNA经纯化和混匀后送北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成高通量测序。

1.4 数据处理

利用FLASH v1.2.7(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对每个样本序列进行拼接。通过UCHIME算法(http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)去除错配和模糊序列。利用Uparse v7.0.1001软件(http://drive5.com/uparse/)将每个样品中的基因序列在97%的相似度下聚类成运算分类单元(OTU)，同时与RDP数据库进行比对，获得每种OTU在各个水平下的分类单元。另外，在进行Beta多样性分析时，对每个样品按照最少序列数进行抽平。

试验数据处理采用WPS Office 2019软件完成，用R x64 3.5.1软件中的vegan程序包计算Shannon指数，用Pheatmap程序做热图，用Venndiagram程序包做Venn图，用Vegan、Labdsv、Ape、Ggplot2程序包进行主坐标分析(PCoA)，并绘制成图。

2 结果与分析

2.1 对小麦根际分区OTU数量的影响

对16S rRNA高通量测序结果(图1)进行分析可知，不加生物炭处理的小麦根内(E)、根际(R)和空白土壤(S)样品中分别测得OTU数量2 140、2 403和2 503个；加生物炭处理的小麦根内(EB)、根际(RB)和空白土壤(SB)样品中分别测得OTU数量1 699、2 429和2 768个。在不加生物炭的条件下(图1-A)，根内、根际和空白土壤样品中共有的OTU数量为1 405个，分别占根内、根际和空白土壤样品中OTU数量的66%、58%和56%；根内样品中的特有OTU数量为240个，根际样品中的特有OTU数量为560个，空白土壤样品中的特有OTU数量为429个，分别占相应样品OTU总数的11%、23%和17%。在加生物炭的条件下(图1-B)，根内、根际和空白土壤样品中共有的OTU数量为1 249个，分别占根内、根际和空白土壤样品中OTU数量的74%、51%和45%；根内样品中的特有OTU数量为231个，根际样品中的特有OTU数量为184个，空白土壤样品中的特有OTU数量为644个，分别占相应样品OTU总数的14%、8%和23%。从上述结果可以看出，样品中共有OUT的比例在空白土壤、根际和根内样品中依次递增，表明植物根系对于根内微生物的定殖具有筛选过滤作用，即仅有部分微生物种类可以在根内环境中生长和繁殖。植物通过根系分泌物吸引特定土壤微生物在其根际附近富集，然后选择部分微生物进入其根系内部生长。Coleman-Derr等[20]在对拟南芥根际微生物组的研究中也发现类似的结果，即绝大部分在根内富集的微生物同样也在根际和非根际土壤环境中存在。

E，不加生物炭的根内微生物；R，不加生物炭的根际微生物；S，不加生物炭的空白土壤微生物；EB，加生物炭的根内微生物；RB，加生物炭的根际微生物；SB，加生物炭的空白土壤微生物。下同。a，不加生物炭处理下根内、根际和空白土壤的微生物对比；b，加生物炭处理下根内、根际和空白土壤的微生物对比；c，不加生物炭和加生物炭处理的根内微生物对比；d，不加生物炭和加生物炭处理的根际微生物对比；e，不加生物炭和加生物炭处理的空白土壤微生物对比。E， Microbiome in endosphere without biochar addition; R， Microbiome in rhizosphere without biochar addition; S， Microbiome in bulk soils without biochar addition; EB， Microbiome in endosphere with biochar addition; RB， Microbiome in rhizosphere with biochar addition; SB， Microbiome in bulk soils with biochar addition. The same as below. a， Comparison of microbiome without biochar addition; b， Comparison of microbiome with biochar addition; c， Comparison of microbiome in endosphere under different treatments; d， Comparison of microbiome in rhizosphere under different treatments; e， Comparison of microbiome in bulk soils under different treatments.图1 不同处理微生物群落组成的Venn图Fig.1 Venn diagram of microbial community composition under different treatments

通过比较加生物炭和不加生物炭处理根际和空白土壤样品中的OTU数量可知，生物炭的加入使其共有OTU数量增加(加生物炭处理下为2 075个，不加生物炭的处理下为1 711个)，这说明生物炭的添加能够缩小空白土壤与根际土壤样品中微生物组成的多样性差异。此外，通过分别比较加生物炭和不加生物炭处理根内、根际和空白土壤中共有和特有OTU的数量组成可以看出(图1-C～E)，其共有OTU的比例均在50%以上，但也存在一定比例的特有OTU，说明生物炭能够影响小麦的根际微生物种类和数量。

2.2 对小麦根际分区微生物多样性的影响

柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05.图2 不同处理的Shannon指数Fig.2 Shannon index under different treatments

Shannon指数常被用来估算群落多样性，值越大，表明样品中的物种越丰富。如图2所示，在加生物炭的条件下，小麦根内、根际和空白土壤中的Shannon指数值分别为2.54、5.04和5.43；在不加生物炭的条件下，小麦根内、根际和空白土壤中的Shannon指数值分别为2.93、5.08和5.25。方差分析结果显示，加或不加生物炭对根际、根内或空白土壤中微生物的多样性无显著影响，但同样在加生物炭或不加生物炭的处理下，根内微生物的多样性均显著(P<0.05)少于根际和空白土壤中的微生物多样性。这表明，植物根系对微生物具有一定的筛选作用，仅部分微生物能够成功在根内定殖生长。Lundberg等[10]研究了600种拟南芥的根际微生物组，发现拟南芥根内微生物的Shannon指数远远低于根际和土壤。类似地，Edwards等[17]对水稻根际微生物组的研究也发现相同的结果，表明水稻根系对其根内微生物的定殖起着过滤和筛选的作用。程扬等[21]研究表明，秸秆生物炭对玉米根际微生物群落多样性无显著影响。但也有研究表明，生物炭施用能够增加或降低根际微生物的多样性。如邹春娇等[22]在生物炭对黄瓜根域微生物的调节研究中发现，生物炭能显著提高土壤中细菌的群落结构多样性。这表明根际微生物群落多样性对生物炭的响应存在不一致性，推测可能与生物炭性质、土壤微生物结构等因素有关。

图3 全部处理下根内、根际和空白土壤中的微生物群落PCoA分析Fig.3 PCoA analysis of microbial community in endosphere， rhizosphere and bunk soil under all treatments

2.3 对小麦根际分区微生物β多样性的影响

对比加生物炭和不加生物炭处理下根际区域环境中微生物的群落结构差异，结果如图3所示。在整体(包含全部处理和全部根际分区)的微生物群落比较中，主成分1(PCo1)的贡献率为61.2%，主成分2(PCo2)的贡献率为21.6%，二者合计可以解释所有样品82.8%的微生物群落组成差异。其中，根际和空白土壤样品在主坐标轴1上可以得到很好的区分。

采用非参数多元方差分析(PERMANOVA)比较影响根际微生物群落组成的显著性因素。结果表明，不同分区(根际、根内和空白土壤)的微生物群落结构组成差异显著(P<0.05)，换言之，不同分区是影响根际微生物群落组成最主要的因素。

在根际和空白土壤样品中，加生物炭与不加生物炭处理的微生物群落结构在主坐标2上得到了很好的区分(图3)。PERMANOVA结果发现，不管是在根内还是在根际环境中，加生物炭均会对其微生物群落结构组成产生显著(P<0.05)影响，说明生物炭能够显著影响小麦根际微生物的结构组成。

2.4 对小麦根际分区细菌门水平上的影响

图4表征了加生物炭和不加生物炭条件下门水平上相对丰度排名前10的细菌种类。从整体分布看，变形菌门(Proteobacteria)是根内、根际和空白土壤中的最优势菌门，平均相对丰度分别为51.1%、56.2%和51.4%，生物炭对变形菌门在不同分区中的丰度影响不大。蓝藻门(Cyanobacteria)在根内环境中的相对丰度(37.8%)远高于在根际(4.8%)和空白土壤(3.5%)中的相对丰度，是小麦根内的第二大优势菌门。相反地，放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)在根际和空白土壤中的相对丰度高于根内。综上所述，Proteobacteria和Cyanobacteria是小麦根内的优势菌门。部分研究发现，放线菌门、变形杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是植物根内(如拟南芥、燕麦等)的优势菌门[23-25]，与本研究结果存在部分差异，这可能与宿主植物类型和土壤性质有关。

图4 不加生物炭(a)和加生物炭(b)处理下主要菌门的相对丰度Fig.4 Relative abundance of main phyla under treatments without (a) or with (b) biochar addition

加生物炭和不加生物炭处理下，不同细菌在根内、根际和空白土壤中的变化趋势相似，但其相对丰度存在差异。由图4可知，加生物炭能够增加根际和空白土壤中部分菌门的相对丰度。在加生物炭的条件下，Acidobacteria在根际和空白土壤中的平均相对丰度分别为5.5%和15.6%，高于不加生物炭条件下其在根际和空白土壤中的含量。同样地，Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes在加生物炭条件下的相对丰度也高于不加生物炭条件下。不过，加生物炭也会使得部分微生物的相对丰度降低，如Actinobacteria等。本研究表明，生物炭能够改变小麦根际区域中微生物群落的结构组成，促进特定功能微生物的生长繁殖。Graber等[13]也发现，生物炭的添加能够刺激马铃薯根际区域中降解糖类和酚类物质的细菌和Verrucomicrobia细菌的生长。

2.5 对小麦根际分区细菌属水平上的影响

从属的分类水平上对不同处理的微生物相对丰度分布进行聚类分析。由图5可知，所有样品整体可以聚类为根内、根际和空白土壤3大部分，且不同部分的高含量微生物种属具有明显差异。在根内，相对丰度较高的菌属主要包括鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、马赛菌属(Massilia)、不黏柄菌属(Asticcacaulis)、地杆菌属(Terrabacter)；在根际，相对丰度较高的菌属主要包括Sphingomonas、Massilia、单胞菌属(Stenotrophomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)；在空白土壤中，相对丰度较高的菌属主要包括Sphingomonas、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、Massilia。任慧爽等[26]研究桑树内生细菌多样性时发现，Sphingomonas、Massilia是其内生优势菌属。Massilia是植物根际和根内定殖的主要菌属，能够在多种植物的根际和根内环境中生长[27]。Sphingomonas和Rhizobium具有固氮作用，能够提升植物对氮的吸收和利用效率[28]。这些菌属在根际范围内的相对丰度较高，有助于植物的营养吸收和生长。

在属的水平上，生物炭能够明显促进不同根际分区特定性功能微生物的生长。在加生物炭的条件下，根内相对丰度较高的菌属包括Sphingomonas(2.9%)、Rhizobium(1.7%)和德沃斯氏菌属(Devosia，0.8%)；在不加生物炭的条件下，根内相对丰度较高的菌属包括Sphingomonas(4.3%)、Rhizobium(1.8%)、Massilia(0.6%)和Devosia(0.6%)。聚类分析结果表明，生物炭对根际和空白土壤微生物群落的影响要高于对根内细菌的影响。在根际，与不加生物炭的处理相比，加生物炭能够提升Sphingomonas(15.5%)、Massilia(5.3%)和Bacillus(4.0%)的相对丰度。然而，根际也有部分菌属的相对丰度在生物炭的影响下存在下降趋势。造成差异的原因是，添加生物炭能够影响土壤理化性质和小麦根系分泌物成分，从而使得根际环境中某些微生物的生长得到促进或者抑制。此外，还可能与生物炭本身的多孔性特征有一定的关系。生物炭的多孔性可以调节土壤中微生物的组成分布，从而使得土壤根际微生物种群的结构组成发生变化。

对相对丰度值取常用对数。The relative abundance was calculated by common logarithm.图5 属水平上主要细菌的菌属分析Fig.5 Analysis of main microbial community composition at genus level

2.6 对根际和根内标志微生物结构组成的影响

为了明确生物炭对小麦根际和根内微生物结构组成的影响，通过LEfSe分析分别比较加生物炭和不加生物炭处理下小麦根际和根内具有显著差异(P<0.05)的微生物种类(图6)。结果表明，相对于根内环境，加生物炭后，根际环境中相对丰度显著(P<0.05)增加的微生物种类更多，组成更为复杂。在根内环境中(图6-a)，加生物炭显著(P<0.05)提高了疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)和Luteolibacter菌的相对丰度，这二者为加生物炭条件下的根内特征菌群。不加生物炭条件下，根内环境中变形菌纲(Deltaproteobacteria)、红螺菌目(Rhodospirillales)、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)和Sphingomonas的相对丰度显著(P<0.05)高于加生物炭条件下，为不加生物炭条件下的根内特征菌群。Nielsen等[29]的研究也发现，加生物炭条件下，归属于Verrucomicrobiaceae的菌群相对丰度升高，认为与硝酸盐含量和电导率存在相关关系。

LDA值为取常用对数后的结果。LDA score was the result after common logarithm.图6 加与不加生物炭条件下小麦根内(a)和根际(b)环境中微生物种类的变化Fig.6 Comparison of microbial community in endosphere (a) and rhizosphere (b) under treatments with or without biochar addition

在根际环境中，生物炭同样能够促进多种微生物菌群的生长，使其丰度增加。对比加生物炭和不加生物炭条件下具有显著性(P<0.05)差异的微生物群落组成(图6-b)发现，加生物炭条件下根际的特征菌群主要包括疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、芽孢杆菌目(Bacillales)、环脂酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、Luteolibacter、Tumebacillus、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、小坂菌属(Kosakonia)、溶杆菌属(Lysobacter)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、Blastomonas、马赛菌属(Mssilia)、原囊菌属(Archangium)和肠杆菌属(Enterobacter)。综上，根际微生物群落对生物炭处理更加敏感，生物炭的添加显著影响根际标志微生物种类。许多研究表明，生物炭对根际微生物的增殖有促进作用。韩光明等[30]研究生物炭对菠菜根际微生物的影响时发现，向土壤中添加适当浓度的生物炭能够增加根际微生物中氨化细菌和好氧自生固氮菌的数量。王明元等[31]研究表明，在加入高浓度香蕉假茎生物炭的土壤样品中，拟杆菌门、疣微菌门和厚壁菌门的相对丰度显著增加。Lysobacter、Enterobacter和Pseudoxanthomonas是常见的根际促生菌(PGPR)，在促进植物生长发育、抵御病虫害和增强植物抵抗力等方面具有重要作用[32-33]。本研究中这些菌属的相对丰度在加生物炭的条件下均较不加生物炭条件下显著增加，表明生物炭可以通过促进PGPR的生长间接调节作物的生长发育过程，从而达到作物增产提效的目标。

3 结论

本研究通过盆栽试验，利用高通量测序技术分析了生物炭对小麦根内、根际和空白土壤中细菌群落结构组成的影响。结果发现，小麦根内微生物多样性远远低于根际和土壤环境中的微生物多样性，变形菌门(Proteobacteria)和蓝藻门(Cyanobacteria)是小麦根内环境中的优势菌门，小麦根系对于根内微生物具有过滤和筛选作用。生物炭能够影响小麦根内、根际和空白对照土壤环境中的微生物群落结构，且差异具有显著性(P<0.05)。加生物炭条件下，根际环境中丰度显著增加的微生物种类显著高于根内环境，根际环境中疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)等菌门和菌属的相对丰度显著提高。