两种可食用玫瑰生物碱代谢物差异分析

钱晓慧，陈龙清，李双琴，施 蕊

(西南林业大学 园林园艺学院，云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心，云南 昆明 650224)

墨红(RosachinensisJacq.cv. Crimson Glory)和滇红(RosagallicaL. cv. Dianhong)均为云南主栽的可食用重瓣玫瑰，种植面积超过500 hm2，花瓣中富含苯乙醇、芳樟醇、香茅醇和香叶醇等芳香物质[1-2]，可用于提取精油和香料制作。除此之外玫瑰花中也富含黄酮、多酚、色素、蛋白质、氨基酸、微量元素等多种营养成分，具有排毒养颜、疏肝利胆、舒缓定神、抗菌抗病毒、调节体内平衡、降血糖等多种功效[3-4]。谢美玉等[5]为准确地进行品种鉴定，分别对这两种食用玫瑰建立了标准指纹图谱。张訸等[6]研究表明，墨红玫瑰里多酚含量大于滇红，但是滇红和墨红的生物碱成分研究尚未见报道。

生物碱作为一大类研究历史悠久、结构多样化的重要天然有机化合物，在人体或动物体内具有动态的生物活性，具有抗菌抗炎(小檗碱、血根碱)、镇痛(吗啡)、抗疟(奎宁)、平喘(麻黄碱)、抗癌(喜树碱)、杀虫(百部生物碱)和降压(血利平)、抗老年痴呆(石杉碱甲)等作用，常用于药品开发和利用，如抗菌药物甲硝唑和喹诺酮类药物[7-11]。在众多的天然产物中，生物碱具有最显著的功能是针对癌细胞的生理功能[12]，但也有一些植物生物碱显示出毒性，如肝、肾、神经、胃肠道和遗传毒性[13-14]。随着对生物碱的深入研究，发现了靠诱导细胞凋亡、调控细胞周期、增加活性氧、抑制DNA拓朴异构酶形成抗癌活性的新型天然生物碱[15]。但从植物中提取得到的天然代谢产物一般含量较低且价格较贵。因此，可通过植物次生代谢途径及其调控机制的研究，并利用代谢工程手段改善代谢途径，优化提高或减少次生代谢产物量[16]，可更好地发挥植物的综合价值以及进行新产品开发。在长春花吲哚生物碱的代谢途径中运用基因工程等手段对关键基因和转录因子进行遗传改造，让长春花药用成分含量的提高具有了可行性[17]；同样用基因工程的方法在解析喜树碱类化合物代谢途径基础上，干扰喜树碱合成代谢流，能在大幅度提高喜树碱产量的同时减轻对细胞本身的毒性作用[18]；除此之外，在茶叶中人为去除过量生物碱会导致茶叶失去特有风味，而通过基因工程等手段来研发和培育各种控制生物碱含量的新品茶叶却有良好的社会意义[19]。同时生物碱代谢生物学的研究成功可为医药及新的化合物提供参考依据[20-21]。本研究采用代谢组学方法探讨两种食用玫瑰中生物碱差异代谢物及代谢途径，可为两种食用玫瑰进一步通过基因工程开发不同功能类型花卉、食品、医药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

墨红(DH)和滇红(ZY)玫瑰均采自云南省大理白族自治州(N25O44′14″，E100°9′50″)，海拔1 970 m。墨红玫瑰，花径约8～12 cm，花瓣具丝绒触感，颜色为深红色，皮刺平直刺，叶卵形，互生；滇红玫瑰，花径约7～12 cm，花瓣为鲜红色，开放后逐渐为紫红色，皮刺斜直刺，叶卵圆或椭圆形，互生[22]。

1.2 方法

1.2.1 试剂

甲醇(Merck)、乙腈(Merck)、乙醇(Merck)为标准品，二甲基亚砜(DMSO)均为色谱纯，水为超纯水。

1.2.2 仪器

微孔滤膜(0.22 μm pore size)；研磨仪(MM 400，Retsch)；色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；超高效液相色谱(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)；串联质谱(Applied Biosystems 4500 QTRAP)。

1.2.3 样品提取

ZY和DH分2组进行代谢研究，DH是对照组，ZY是实验组，每组样品为1个生物学重复，质控样本(mix)由样本(ZY、DH)提取物等量混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性，保障数据的重复性和可靠性。样品花瓣先真空冷冻干燥后用研磨仪(30HZ)研磨1.5 min至粉末状，并称取100 mg的粉末，溶解于1.0 mL甲醇水溶液(70%)中；为提高提取率，将制得的提取液样品于4 ℃冰箱过夜，期间涡旋3次；最后离心(转速10 000×g，10 min)并吸取上清液，用微孔滤膜过滤样品后保存于进样瓶中待测。

1.2.4 样品测定

色谱流动相：水相为超纯水(加入0.04%的乙酸)，有机相为乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脱梯度：0 min水/乙腈(体积比95∶5)，11.0 min体积比为5∶95，12.0 min体积比为5∶95，12.1 min体积比为95∶5，15.0 min体积比为95∶5；流速0.4 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度550 ℃，质谱电压5 500 V， 帘气(curtain gas，CUR)25 psi。

1.3 数据分析

基于数据库MWDB(metware database)及代谢物信息公共数据库，对质谱检测数据进行分析。并与多元统计分析相结合，利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据研究两个品种之间的代谢组差异。

2 结果与分析

2.1 代谢产物的定性和定量分析

通过质控(quality control，QC)样本的总离子流图及MRM代谢物检测，对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，确保定性定量准确。样本的主成分分析结果(表1、图1)显示，ZY、DH、Mix各组之间代谢组呈现分离趋势，表明样品组间代谢组存在差异，其中2D PCA主成分的累计贡献率达75.57%，3D PCA主成分的累计贡献率达92.55%。从滇红(ZY)和墨红(DH)玫瑰花瓣样本中共检测到82种生物碱代谢产物，包括55种氨基酸及其衍生物、16种生物碱、7种酚胺、4种吲哚类生物碱(图2)。对所有样品的数据进行归一化处理后的聚类热图(图3)显示，滇红(ZY)和墨红(DH)玫瑰之间的代谢物较明显分离，与DH相比ZY的生物碱代谢物显著下调。

ZY代表滇红，DH代表墨红，Mix01、Mix02和Mix03代表滇红和墨红提取物等量混合制备的样本。ZY represented Rosa gallica L. cv. Dianhong， DH represented Rosa chinensis Jacq.cv. Crimson Glory， Mix01， Mix02 and Mix03 represented equivalent mixtures sample of ZY and DH.图1 各组样本的二维和三维主成分分析Fig.1 2D PCA and 3D PCA of each sample

表1 滇红( ZY )和墨红( DH )玫瑰中所有主成分分析结果

图2 所有样本中鉴定出的不同类型代谢物的数量Fig.2 Number of different types of metabolites identified in all samples

2.2 差异代谢物筛选及分析

选取差异倍数值≥2和差异倍数值≤0.5的代谢物，差异为2倍以上表示上调，差异为0.5以下表示下调。滇红和墨红玫瑰相比差异倍数大的前20种差异代谢物(图4)，上调的前10种依次为：谷胱甘肽、3-羟丙基棕榈酸酯葡萄糖胺、N-乙酰-L-酪氨酸、阿魏酸精胺、L-高胱氨酸、阿魏酰组胺、1-甲基组氨酸、胍丁胺、(-)-3-(3，4-二羟基苯基)-2-甲基丙氨酸、5-L-谷氨酰-L-丙氨酸；下调的前10种依次为：L-天冬酰胺、S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸、烟酸甲酯、L-谷氨酸、L-(+)-精氨酸、L-谷氨酰胺、N6-乙酰-L-赖氨酸、L-(+)-赖氨酸、L-(-)-苏氨酸、甘氨酰-L-脯氨酸。

列表示不同样本，行表示不同代谢物；颜色深浅表示相关系数的值。The columns represented different samples and the rows represented different metabolites; the depth of color represented the value of the correlation coefficient.图3 DH、ZH和Mix代谢热图Fig.3 Heat map of DH， ZH and Mix

绿色表示下调差异代谢物，红色表示上调差异代谢物，数值表示差异倍数。Green represented down-regulated differential metabolites， red represented up-regulated differential metabolites， and the value represented the multiple of difference.图4 ZY与DH相比差异倍数大的前20种代谢物Fig.4 The top 20 metabolites with fold change between ZY and DH

以ZY为实验组，DH为对照组，选取滇红(ZY)和墨红(DH)花瓣中差异倍数值≥2和差异倍数值≤0.5的差异显著的代谢物(表2)，总共有18种差异较大代谢物，主要有2种成分：生物碱和氨基酸及其衍生物，其中上调有3种，分别为N-乙酰-L-酪氨酸(2.56倍)、谷胱甘肽(26.35倍)和3-羟丙基棕榈酸酯葡萄糖胺(3.45倍)。下调的有15种，分别为L-天冬酰胺、烟酸甲酯、L-(-)-苏氨酸、L-(+)-精氨酸、O-乙酰丝氨酸、DL-2-氨基己二酸、D-(-)-缬氨酸、L-瓜氨酸、L-谷氨酸、L-(+)-赖氨酸、DL-高半胱氨酸、N6-乙酰-L-赖氨酸、甘氨酰-L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸。其中3-羟丙基棕榈酸酯葡萄糖胺在滇红玫瑰中的含量最高，比墨红玫瑰高3.45倍，属于生物碱成分；第二丰富的为L-谷氨酸，是墨红玫瑰的0.15倍；第三丰富的D-(-)-缬氨酸，是墨红玫瑰的0.48倍；DL-高半胱氨酸的含量最低，是墨红玫瑰的0.44倍，但L-天冬酰胺和S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸是墨红玫瑰中特有的物质；滇红与墨红相比差异倍数较大的为谷胱甘肽，为26.35倍。在墨红玫瑰的显著差异代谢物中L-天冬酰胺含量最高，其次为L-谷氨酸、烟酸甲酯和L-(+)-精氨酸。氨基酸作为构成蛋白质的基本单位，在化妆品、医药和食品工业中有广泛的应用，S-腺苷-L-高半胱氨酸是合成半胱氨酸和腺苷的代谢中间产物，胱氨酸是形成皮肤不可缺少的物质；天冬酰胺虽不是必需氨基酸，但是天冬酰胺合成酶(ASNS)却是抑制肿瘤生长的关键节点，还可用于制作代糖；精氨酸是一种半必需氨基酸，可促进伤口的愈合，刺激生长激素合成、抗衰老、提高免疫力；缬氨酸等支链氨基酸的注射液可治疗肝功能衰竭等疾病；谷氨酸可治疗肝昏迷等症状；赖氨酸作为碱性人体必需且不能自身合成的氨基酸之一，被开发出多种功能性食品和饮料[23-27]。谷胱甘肽与改善线粒体功能有关，可减轻小鼠酒精性肝病模型肝损伤[28]。

表2 滇红( ZY )和墨红( DH )玫瑰中的显著代谢物

2.3 差异代谢物KEGG功能注释及富集分析

差异代谢物进行了KEGG功能注释后(图5)，进行富集统计分析后发现差异代谢物主要参与了两种生物合成：氨基酸生物合成途径和植物次生代谢合成途径，其中较大的差异代谢组为氨基酸生物合成，数量为10，占76.92%，富集因子0.59；其次为植物次生代谢合成，数量为8，占61.54%，富集因子0.47。

为进一步研究滇红和墨红玫瑰间的差异，差异代谢物在KEGG图上标注(图6)后显示，在氨基酸生物合成途径中ZY显著下调的显著差异代谢物有：S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸、O-乙酰丝氨酸、L-(-)-苏氨酸、L-谷氨酰胺、DL-高半胱氨酸、L-(+)-赖氨酸、L-谷氨酸、L-瓜氨酸、L-(+)-精氨酸、L-(-)-苏氨酸；被检测到但无显著变化的代谢物有：L-色氨酸、L-(-)-酪氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、2,6-二氨基庚二酸。

3 讨论与结论

通过代谢组学对滇红(ZY)和墨红(DH)玫瑰分析比较后，总共筛选到82种生物碱代谢产物，包括55种氨基酸及其衍生物、16种生物碱、7种酚胺、4种吲哚类生物碱。其中有18种差异较大代谢物，主要有2种成分：生物碱和氨基酸及其衍生物，其中上调有3种，下调的有15种。差异代谢物进行了KEGG功能注释后，进行富集统计分析后发现，差异代谢物主要参与了两种生物合成：氨基酸生物合成途径和植物次生代谢合成途径。

圆点的大小表示富集的差异代谢物的数量，颜色表示显著值，富集因子表示在对应通路中差异表达的代谢物的个数与该通路检测注释到的代谢物总数的比值。The size of the dot indicated the amount of enriched metabolites， the color indicated the significant value， and the enrichment factor indicated that the ratio of the number of metabolites differentially expressed in the corresponding pathway to the total number of metabolites detected and annotated by the pathway.图5 KEGG富集统计图Fig.5 Statistic of KEGG enrichment

云南滇红和墨红玫瑰中差异代谢物参与的氨基酸代谢不仅仅是增加蛋白质合成，还有支持多种免疫细胞功能[29]，具有较高的开发价值。除了酵法及酶法生产氨基酸及其衍生物，也可运用绿色生物技术从植物中增加其含量[30]，综合利用滇红和墨红的颜色与香气可开发丰富的多功能性产品。郑淑彦[31]等研究发现，食用玫瑰中含有所占比例较高的苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等人体必需氨基酸，特别是赖氨酸的含量很高。时羽杰等[32]用GC-MS技术以及多元统计分析对两地的白色藜麦种子进行比较，发现谷胱甘肽在四川盐源的藜麦中有更高的表达水平，较青海都兰的白色藜麦有更强的抗氧化能力、抗逆性和适应性。本研究对比了滇红和墨红玫瑰中的18种差异代谢物，发现二者之间生物碱成分有一定差距，在滇红玫瑰的氨基酸生物合成途径中下调的就有15种。墨红玫瑰与滇红玫瑰相比特有L-天冬酰胺和S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸两种氨基酸及其衍生物，L-天冬酰胺可作为添加剂与糖共热反应形成特殊香味物质，用于清凉饮料[33]。S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸是半胱氨酸和腺苷合成的中间体，半胱氨酸为人体半必需氨基酸，腺苷常用于药品制备。而滇红玫瑰与墨红玫瑰相比，上调差异倍数较大的为谷胱甘肽，是墨红玫瑰的26.35倍，此代谢物具有较强的清除氧自由基能力。综上，墨红玫瑰较滇红玫瑰有较高的营养保健功能，而滇红玫瑰具有更强的抗氧化能力，因此，可以通过基因调控或基因改良的方法对不同功效的玫瑰品种进行优选和新品种选育，定向培育，为食用玫瑰的功效物质提取，制备功能性食品和生物医药产品奠定了坚实的理论研究基础。

绿色实线代表显著下调差异代谢物，蓝色虚线代表检测到但无显著变化差异代谢物。Green lines represented significant down-regulated differential metabolites， blue dotted line represented the detected metabolites with no significant difference.图6 氨基酸生物合成途径中DH和ZH的差异代谢物图Fig.6 Differential metabolites in Biosynthesis of amino acids pathways in DH and ZY