浙江省亚洲柑橘木虱黄龙病病原分布与消长规律

孟幼青，汪恩国，陈吴健，李艳敏，程 帆，孟敏霞

(1.浙江省植保检疫与农药管理总站，浙江 杭州 310020； 2.临海市农业技术推广中心，浙江 临海 317000； 3.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 310016； 4.诸暨市农业农村局，浙江 诸暨 311800)

浙江地处亚热带季风气候区，柑橘是全省第一大水果，产地主要集中在温州、丽水、台州、宁波、衢州、杭州6市的20余个县(市、区)，全省种植面积8.80万hm2，年产量180余万t，年产值超45亿元。黄岩蜜橘、临海(涌泉)蜜橘、象山红美人、苍南(马站)四季柚、温州瓯柑、玉环文旦、庆元甜橘柚等优良品种享誉海内外[1-2]。2000年以来，柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)在浙江扩散为害，成为制约当地优势柑橘产业持续发展的重要障碍[2-8]。学者们围绕柑橘黄龙病已经进行了许多研究[3-16]，发现黄龙病在我国主要通过亚洲柑橘木虱(DiaphorinacitriKuwayama，又称Asian citrus psyllid)作为介体传染传播扩散，其病原菌主要为CandidatusLiberibacterasiaticus(CLas)。梳理现有研究：乌天宇等[3]针对亚洲柑橘木虱成虫和若虫感染HLB的获菌效率，Grafton-Cardwell等[4]针对亚洲柑橘木虱的生物学防治，陈梦瑶等[6]针对长链非编码RNA(lncRNA)在亚洲柑橘木虱与CLas上的互作效率验证等做了较细研究；但仍缺乏关于亚洲柑橘木虱的CLas阳性大范围分布变化及其扩散感染规律的研究。为了更好地探清介体昆虫亚洲柑橘木虱上CLas的阳性分布特性和月(年)度变化规律，明确其CLas阳性分布区域和适宜治虫防病的窗口期，笔者于2002—2019年针对浙江柑橘果园的分布情况，对全省重点果园的亚洲柑橘木虱进行采样检测，通过荧光定量PCR技术，对CLas阳性分布特性、CLas阳性率消长轨迹等进行研究，以期为提升柑橘黄龙病的监测预警防控水平提供科学依据，助力浙江省优势柑橘产业的健康持续发展。

1 材料与方法

1.1 亚洲柑橘木虱CLas采样方法

针对浙江省柑橘种植的分布情况，突出重点产区重点果园，于2002—2019年对温州、台州、丽水、宁波和金华等5市的苍南、泰顺、瑞安、龙湾、瓯海、永嘉、乐清、玉环、温岭、路桥、椒江、黄岩、临海、仙居、三门、青田、莲都、缙云、云和、龙泉、宁海、象山、永康、金东等24个县(市、区)发生亚洲柑橘木虱的柑橘果园，采用定园定期和不定园不定期相结合的方式进行采样。在果园中，以梅花式确定柑橘树若干株，原则上每株依东南西北中5个方位采集亚洲柑橘木虱成虫，一般每园采集虫量控制在50～100头，定检30～45头。黄龙病样品每果园采样100株，每株按东南西北中采5叶为1样品。

1.2 亚洲柑橘木虱CLas检测方法

1.2.1 样品前处理

样品制备所使用的工具——剪刀、镊子、研钵等，均经121 ℃ 30 min高压蒸汽灭菌处理。处理完不同样品后，工具均使用70%乙醇溶液擦拭2次，以避免样品间的交叉污染。

待测柑橘组织样品(叶片)处理：撕取叶片中脉，放于消毒灭菌研钵中，加入液氮研成粉末，取约200 mg粉末装入1.5 mL离心管中，用于提取DNA。

亚洲柑橘木虱样品处理：挑取单头木虱，清水漂洗干净后，放入1.5 mL离心管内，用塑料研磨棒磨碎，加200 μL裂解液，用于提取DNA。

1.2.2 样品DNA提取

由罗氏公司的全自动核酸提取仪(型号为Roche MagNA Pure96)与试剂盒MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit结合使用完成。

1.2.3 PCR扩增检测

参照国家标准GB/T 28062—2011中的黄龙病亚洲种实时荧光PCR检测探针法，使用罗氏公司的Light Cycler 480 II实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增。

1.2.4 标准曲线绘制

根据GB/T 28062—2011中的黄龙病亚洲种实时荧光PCR检测引物扩增柑橘黄龙病菌目标基因，目标片段大小为87 bp，通过TA克隆将克隆出的片段保存于T载体中，得到标准阳性样品。对标准样品进行10倍梯度(101～106)稀释，分别进行荧光定量PCR分析，构建标准曲线。

1.2.5 检测结果的判定

直接读取检测结果，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准，阴性对照和空白对照应无Ct值，并且无扩增曲线；否则，此次检测视为无效。阳性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线，否则此次检测视为无效。

测试样品的检测Ct值≥40或者无Ct值并且无扩增曲线，且阴性对照、阳性对照、空白对照结果正常的，判定该样品为阴性；测试样品的检测Ct值≤35，出现典型的扩增曲线，且阴性对照、阳性对照、空白对照结果正常的，判定该样品为阳性。

1.3 数据计算

使用Excel 2020进行数据整理。计算亚洲柑橘木虱的Clas携菌量及其阳性率。

2 结果与分析

2.1 浙江省亚洲柑橘木虱CLas阳性分布特性

如图1所示，于2014年从瓯海、瑞安、乐清、苍南、永嘉、椒江、路桥、温岭、莲都、青田、云和、金东、永康等地的18个柑橘果园采集亚洲柑橘木虱成虫，检测表明，在东西方向上亚洲柑橘木虱的CLas阳性率自东向西逐渐减弱。对亚洲柑橘木虱的CLas携菌量(y)与果园所处经度(x1)进行建模：y=56 046 308.55x1-6 713 626 279.00(n=18，R2=0.509 0，P=0.000 9)。当y=0时，x1=119.80，即理论上浙江省亚洲柑橘木虱CLas阳性分布范围主要为119.80°E以东的柑橘果园。于2017—2019年从地处浙西衢江(29.00°N，119.04°E)的果园中采检样品300个，亚洲柑橘木虱的CLas携菌量均为0。由此可见，浙江省亚洲柑橘木虱CLas的阳性分布西缘约为119.80°E。

图1 浙江省不同经度果园内柑橘木虱成虫CLas携菌量的变化趋势Fig.1 Variation of CLas quantity in adult Asian citrus psyllid in Zhejiang orchards from west to east

如图2所示，于2014年对2000年以后入侵感染黄龙病的乐清、椒江、路桥、温岭、临海、三门、仙居、莲都、青田、龙泉、永康、宁海、象山等13个县(市、区)的柑橘果园进行亚洲柑橘木虱成虫采样，经检测分析，浙江省亚洲柑橘木虱的CLas阳性分布表现出自南向北逐渐扩散减弱的趋势。对亚洲柑橘木虱的CLas携菌量(y)与果园所处纬度(x2)进行建模：y=-85 782 543.81x2+2 503 928 411.0(n=13，R2=0.337 5，P=0.037 3)。当y=0时，x2=29.20，即理论上浙江省亚洲柑橘木虱CLas阳性的分布范围主要为29.20°N以南的柑橘果园。由此可见，理论上，浙江省亚洲柑橘木虱的CLas阳性分布北缘为29.20°N左右。

2.2 亚洲柑橘木虱CLas阳性率与HLB发病率的关系

图2 浙江省不同纬度果园内柑橘木虱成虫CLas菌量的变化趋势Fig.2 Variation of CLas quantity in adult Asian citrus psyllid in Zhejiang orchards from north to south

于2002—2003年对浙东南的黄岩、乐清、莲都等3市(区)的13个柑橘果园采集样本，检测其亚洲柑橘木虱CLas阳性率和HLB发病率，结果如表1所示。对表1的数据进行回归分析，发现所调查的果园中亚洲柑橘木虱的CLas阳性率(y1)与HLB发病率(x3)存在极显著(P<0.01)的逻辑斯蒂模型(Logistic model)关系，拟合的回归方程为以上结果表明，柑橘果园HLB病株是亚洲柑橘木虱成虫吸食带菌的重要菌源基础，亚洲柑橘木虱成虫的CLas阳性率随果园HLB发病率上升而提高。

2.3 浙江省亚洲柑橘木虱CLas阳性率消长动态

2.3.1 月际消长轨迹

于2003年3月至2004年2月选定乐清市湖雾镇兴上村的某柑橘果园逐月采集亚洲柑橘木虱成虫样品，检测其CLas阳性率，从当年3月开始到次年2月结束，每月3次重复，每重复采检成虫30头。如图3所示，亚洲柑橘木虱CLas阳性率月际变化呈波浪式山峰型结构：第1峰为4月份，即果园内亚洲柑橘木虱种群春峰活动期；第2峰为7月份，即果园夏梢期，此时亚洲柑橘木虱种群处于低谷期，但CLas阳性率相对趋高；第3峰为12月份，为全年性秋后CLas阳性高峰期，此时的亚洲柑橘木虱种群经秋繁活动后，到12月形成了越冬性虫源阳性高峰。从治虫防病角度来看，春、夏、秋3梢初期为最佳的窗口期，应加强3梢初期的治虫防病，以免梢期阳性成峰，尤要注意的是12月份，亚洲柑橘木虱虫口正值越冬性环境，无法用药防控，若不提前防控，即使当时用药，效果也不甚理想。

表1 浙东南13个柑橘果园的亚洲柑橘木虱CLas阳性率与HLB发病率

图3 浙南果园亚洲柑橘木虱CLas阳性率的月际变化Fig.3 Monthly variation of CLas positive rate in orchard of southern Zhejiang

图4 浙江省内果园亚洲柑橘木虱CLas阳性率的年际变化Fig.4 Annual variation of CLas positive rate in Zhejiang orchards

2.3.2 年限消长轨迹

3 讨论

3.1 浙江省亚洲柑橘木虱CLas携菌量分布呈现由南而北、自东向西双向递弱趋势

对浙江省亚洲柑橘木虱CLas携菌量与果园经纬度的关系进行分析，结果显示，自东向西、由南而北，其CLas携菌量逐渐减弱，且携菌量与经纬度分别呈线性关系。推算发现，浙江省亚洲柑橘木虱CLas阳性分布范围为：北至29.20°N，西至119.80°E左右。这与王晓亮等[16]在浙江、福建、江西、湖北、湖南、广东、广西、海南、重庆、四川、贵州、云南等地开展亚洲柑橘木虱专项调查确认的北界29°29′N基本一致。但本研究从CLas携菌量上进行推测，首次明确浙江省亚洲柑橘木虱CLas阳性分布西缘在119.80°E左右。

3.2 浙江省亚洲柑橘木虱CLas阳性率与HLB发病率呈逻辑斯蒂模型变化规律

对乐清、黄岩、莲都3市(区)13个果园柑橘木虱CLas阳性率与HLB发病率的关系进行测定，发现亚洲柑橘木虱CLas阳性率随HLB发病率增加而上升，并呈逻辑斯蒂变化规律，HLB发病严重的柑橘果园，亚洲柑橘木虱CLas阳性率亦高。

3.3 浙江省亚洲柑橘木虱CLas阳性率在月际间呈3峰型、年际间呈2次曲线变化规律

对乐清市湖雾镇兴上村某柑橘果园逐月采样检测发现，其CLas阳性率月际间表现为山峰型波浪式变化结构，峰期分别为4、7、12月，分别对应亚洲柑橘木虱种群春繁活动，盛夏低谷相对阳性率高峰和秋后越冬虫源高峰，其阳性率分别为43.33%、60.00%、63.33%，有逐峰逐浪升高的趋势。余继华等[11]认为，冬季和春季为亚洲柑橘木虱防治的最佳窗口期，但其只考虑了CLas阳性成峰，忽略了昆虫的越冬特性。本研究从治虫防病实际需求的角度分析，认为春、夏、秋3梢初期为最佳窗口期。加强3梢初期的治虫防病，既可提高持续控制亚洲柑橘木虱的效果，又可严防各梢期亚洲柑橘木虱CLas阳性率成峰，料想对柑橘果园HLB的整体防治效果具有更大意义。

以2001年为起始年，根据年际间亚洲柑橘木虱CLas阳性率的变化趋势推算，理论上2010年浙江省亚洲柑橘木虱CLas阳性率处于最高值，然后趋于缓降，并预计2021年将进入新的周期性变化轨道。此变化规律，既是亚洲柑橘木虱种群自身行为活动的结果，也是坚持人为持续治虫防病和浙江省柑橘黄龙病整体检疫防控共同效应的成果。