响应面法优化大豆胚芽黄酮的提取工艺

苗颖,南海娟,郝亚勤,赵圣明,黄少帅

（1.河南科技学院食品学院,河南新乡453003；2.河南加多多食品有限公司,河南新乡453003）

大豆胚芽具有很高的营养价值,其富含生理活性物质维生素E,大豆异黄酮和甾醇等.黄酮类化合物又名生物类黄酮化合物,是色原酮或色原烷的衍生物,目前检测总黄酮含量的方法有紫外分光光度法[1]、荧光分光光度法[2]以及高效液相法[3]等.

黄酮类化合物能预防多种疾病,是保健食品的功能因子之一[4].通常,黄酮类化合物的提取工艺主要有萃取法、超滤法、超声波法、微波消解等方法[5-7],其中萃取法应用最为广泛.醇提法是在萃取法中常用的单元操作,而乙醇的浓度、提取时间和提取温度等因素对目标提取率有较大的影响.因此,如何选择适宜的提取条件显得尤为重要.

利用响应面分析法可建立提取条件和提取率的数学模型,预测最优的提取条件和提取率,是一种解决多变量问题的科学统计方法.本研究以大豆胚芽为试验材料,采用乙醇提取工艺借助响应面分析法对大豆胚芽中的黄酮进行提取,旨在获得最佳提取工艺,为大豆胚芽的综合利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1原料 大豆胚芽,由郑州鑫鑫豆制品加工厂提供.

1.1.2主要试剂 葛根素、AlCl3、NaOH、无水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3,均为分析纯.

1.1.3仪器与设备ZM-2248中药材粉碎机,广州真麦机械设备有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司；SHA-C数显水浴恒温振荡器,金振华峰仪器有限公司；SHA-C数显水浴恒温振荡器,金振华峰仪器有限公司；SHZ-DⅢ循环水式真空泵,河南智诚科技发展有限公司；旋转蒸发器RE-599,河南智诚科技发展有限公司；L420台式低速自动平衡离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DZF-6050型真空干燥箱,上海精宏实验设备有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1黄酮的定性 盐酸-镁粉（或锌粉）反应为鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应,因为黄酮类化合分子中含的结构单元,常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐、锶盐、铁盐等试剂反应,生成有色络合物[8].

（1）取样品提取液于试管中,滴加FeCl3溶液,若显墨绿色,滴加NaOH显橙红色,说明有黄酮类物质.（2）取样品提取液于试管中,加入数滴AlCl3溶液,若变为黄色,证明提取液中有黄酮类物质.

1.2.2标准曲线的绘制 精密称取葛根素标准品2.5 mg,置于250 mL容量瓶中,以蒸馏水溶解后定容至刻度,摇匀,得到质量浓度为10 mg/mL葛根素标准溶液.分别准确量取0.0,5.0,10.0,15.0,20.0 mL葛根素标准溶液于25 mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,在波长250 nm处测定其吸光值,绘制葛根素含量与吸光度的标准曲线.

1.2.3大豆胚芽的样品处理及总黄酮含量的测定方法

1.2.3.1样品处理方法 大豆胚芽经60℃烘干,粉碎,过80目的筛子,得大豆胚芽粉,即为样品.将样品放入密封的玻璃瓶中,待用.

1.2.3.2总黄酮的测定方法 称取3 g样品,放入锥形瓶中,加入体积分数为60%乙醇150 mL,于50℃水浴中振荡提取4 h后抽滤,滤液转入500 mL容量瓶,滤渣再移入锥形瓶,加入体积分数为60%乙醇150 mL,50℃振荡水浴提取4 h,连续3次,每次抽滤.然后将所有滤液在50℃条件下旋转蒸发1 h左右,当滤液剩余8～10 mL,倒入培养皿中,真空干燥8 h,最后加入体积分数为60%乙醇定容至50 mL,按1.2.2的方法测定吸光值,样品中总黄酮含量的计算公式为

式（1）中：A为吸光度,M/g为样品质量,V/mL为定容体积.

1.2.4大豆胚芽中黄酮最佳提取条件的确定

1.2.4.1单因素试验

1.2.4.1.1提取时间 向100 mL锥形瓶中加入0.4 g样品,根据预试验结果,设定乙醇体积分数为60%,提取温度为40℃,液料比50,时间分别为20 min、40 min、60 min、80 min、100 min,水浴振荡提取.提取结束后,冷却离心,取上清液定容后,按1.2.2中的方法测吸光度,在标准曲线上查出相应的黄酮的量.用求得的黄酮量除以总黄酮量,即可得出大豆胚芽中黄酮的提取率.考察提取时间对大豆胚芽黄酮提取率的影响.

1.2.4.1.2乙醇体积分数 向100 mL锥形瓶中加入0.4 g样品,提取时间为1.2.4.1.1中的最优结果,提取温度为40℃,液料比50,乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%,提取过程及黄酮测定方法同1.2.4.1.1,考察乙醇浓度对大豆胚芽黄酮提取率的影响.

1.2.4.1.3提取温度 向100 mL锥形瓶中加入0.4 g样品,提取时间为1.2.4.1.1中的最优结果,乙醇体积分数为1.2.4.1.2中的最优结果,液料比50,提取温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃,提取过程及黄酮测定方法同1.2.4.1.1,考察提取温度对大豆胚芽黄酮提取率的影响.

1.2.4.1.4液料比 向100mL锥形瓶中加入0.4g样品,提取时间为1.2.4.1.1中的最优结果,乙醇体积分数为1.2.4.1.2中的最优结果,提取温度为1.2.4.1.3中的最优结果,液料比为别为30、40、50、60、70,提取过程及黄酮测定方法同1.2.4.1.1,考察液料比对大豆胚芽黄酮提取率的影响.

1.2.4.2响应面设计方法 使用软件（Design-ExpertSoftware7.0）中的响应面设计法,以提取率为响应值,将单因素试验得到的最佳条件为基础,设计提取温度、提取时间、液料比、乙醇体积分数4因素3水平的响应面试验方案,根据试验结果拟合数学模型,对模型预测的最佳提取条件进行验证.

2 结果与分析

2.1 黄酮定性

（1）取5mL样品提取液于试管中,滴加3滴FeCl3溶液,提取液显墨绿色；

（2）取5mL样品提取液于试管中,加1mLNaOH溶液,提取液显橙红色；

（3）取5mL样品提取液与试管中,加入4滴AlCl3溶液,提取液变为黄色,可证明提取液中有黄酮[9].

2.2 标准曲线与回归方程

用TU-1810紫外可见分光光度计对样品进行全波长扫描后得最大吸收波长为250nm,以葛根素含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,得到线性回归方程y=0.1158x+0.0083,R2=0.9999,表明吸光度值与葛根素含量有良好的线性关系见图1.

图1 葛根素标准溶液标准曲线Fig.1Standardcurveofpuerarinstandardsolution

2.3 大豆胚芽中黄酮总含量的测定结果

大豆胚芽中总黄酮含量见表1.

表1大豆胚芽中总黄酮含量Tab.1Thecontentoftotalflavonoidsinsoybeangerm

2.4 大豆胚芽中黄酮最佳提取条件的确定

2.4.1单因素试验

2.4.1.1提取时间对黄酮提取率的影响 提取时间对提取率的影响见图2.

由图2可知,黄酮的提取率随时间的增加先增大后减小,60min时提取率最大.这是因为刚开始时黄酮类化合物还未充分溶出,随着提取过程的进行,大豆胚芽中的黄酮逐渐溶入提取液.若提取时间过短,黄酮溶解不充分,提取率较低.但是提取时间过长,提取率也有所下降,这是因为水浴振荡具有较强的机械剪切作用,长时间的作用会破坏黄酮的结构,降低黄酮的提取率,同时组织中大量破裂的细胞,增加了溶液中的杂质含量,使有效成分的溶出受到影响[10].此外长时间的加热,乙醇挥发量增大,导致溶剂中乙醇体积分数降低,从而降低了黄酮的提取效率.因此,最佳的提取时间为60min.

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 The effect of extraction times on the extraction rate in soybean germ

2.4.1.2乙醇体积分数对黄酮提取率的影响 乙醇体积分数对提取率的影响见图3.

图3 乙醇体积分数对提取率的影响Fig.3 The effect of ethanol concentration on the extraction rate

由图3可知,随着乙醇体积分数的增大,大豆胚芽黄酮的提取率先增大后减小.当乙醇体积分数为60%时,提取率最大.原因可能是样品中的一些亲脂类的杂质在高体积分数的乙醇溶液中也可溶出而进入溶液中.因此,高体积分数的乙醇溶液会使样品中的亲脂类物质和黄酮竞争性地进入溶剂体系中,当亲脂类的物质溶出较多时,黄酮的提取率反而降低[11].另外,高体积分数的乙醇势必提高提取的成本,因此,最佳乙醇体积分数为60%.

2.4.1.3温度对大豆胚芽中黄酮提取率的影响 不同温度对大豆胚芽中黄酮提取率的影响见图4.

图4 温度对提取率的影响Fig.4 The effect of temperature on the extraction rate

由图4可知,随着温度升高,提取率逐渐增加,50℃时达到最大,随后开始下降,原因可能是较高的温度会对黄酮的活性和结构有一定的影响[12].因此,最佳提取温度为50℃.

2.4.1.4液料比对大豆胚芽中黄酮提取率的影响 不同液料比对大豆胚芽中黄酮提取率的影响见图5.

图5 液料比对提取率的影响Fig.5 The effect of liquid-material ratio on the extraction rate

由图5可知,在液料比为50之前,随着液料比的增加提取率不断增大,由于液料比的增加,溶剂与浸提物的接触越充分,能在相同时间内溶解出更多的黄酮,相应黄酮提取率就高.如果液料比过小,就没有足够的溶剂浸取出样品中的黄酮,从而使提取率降低.如果液料比过大,会消耗更多的能量和时间,同时使细胞破碎程度下降,从而降低黄酮的提取率[13].因此,最优液料比为50.

2.4.2响应面设计法 响应面实验的因素水平表见表2,响应面试验结果见表3.

表2因素和水平Tab.2 Factors and levels of experimentation

表3响应面试验结果Tab.3 Results of response surface experiment

经Design-Expert Software7.0对试验数据进行分析,拟合得到二次方程式.此黄酮提取率的数学模型如下

R1=77.51-1.06×A+0.55×B-0.87×C+1.41×D+0.10×AB+1.41×AC+0.095×AD+0.77×BC-0.16×BD+1.00×CD-0.47×A2-0.74×B2-0.41×C2-0.15×D2.

式中：A/min为提取时间；B/℃为提取温度；C/%为乙醇体积分数；D为液料比；R1/%为黄酮提取率.黄酮提取率回归方程方差分析表见表4.

表4方差分析结果Tab.4 Results of ANOVA

由表4的Pro＞F值可知,因素的影响次序为：液料比＞提取时间＞乙醇浓度＞提取温度.提取时间的概率值（Pr＞F）＜0.05,说明时间对提取率影响显著,液料比的概率值（Pr＞F）＜0.01,说明液料比对提取率的影响极显著.模型的概率值（Pr＞F）＜0.01,说明该模型是极显著的,能较好地拟合大豆胚芽黄酮的提取条件.

使用Design-Expert Software7.0优化大豆胚芽中黄酮理论适宜提取条件见表5.

表5 Design-Expert软件给出的大豆胚芽中黄酮提取的适宜条件Tab.5 Optimum conditions of extracting flavonoids from soybean germ given by design expert software

为了便于实际操作,将最佳工艺条件修正为：提取温度46.8℃,提取时间60 min,液料比50,乙醇体积分数为60%.对适宜提取条件的验证结果见表6.

表6适宜提取条件的验证结果Tab.6 Validation results of optimumconditions

由表6可知,在修正条件下提取大豆胚芽黄酮的提取率为80.11%,与回归模型的预测值80.22%仅相差0.10%,因此回归方程较好地预测了大豆胚芽黄酮的提取率.

3 结论

（1）本试验建立了以葛根素为标准品,用乙醇水浴振荡提取液进行处理,紫外分光光度法测定大豆胚芽中总黄酮含量的方法,测得原料中总黄酮的含量为10.05 mg/g.

（2）采用响应面法优化黄酮最佳提取条件为：温度46.8℃,时间60 min,液料比50,乙醇体积分数60%,在此工艺条件下提取大豆胚芽中黄酮提取率较高,提取率可达80.11%.