原料乳中嗜冷菌菌群多样性及分析方法研究进展

吴天赐，张娟，李楠

（1.上海大学 生命科学学院，上海200444；2.乳业生物技术国家重点实验室上海乳业生物工程技术研究中心光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海200436）

0 引 言

优质的原料乳是保证乳制品质量的重要因素，随着冷链技术的不断完善，嗜温细菌对原料乳的污染和质量破坏已经得到了一定程度的解决,但仍无法有效控制低温下能够生长繁殖的嗜冷菌。嗜冷菌在低于5℃环境下也能生长繁殖，是在原料乳储藏、运输和生产过程中需要控制的主要菌群之一[1]。嗜冷菌主要分为两类微生物，其一为专性嗜冷菌（Psychrophiles），其二为兼性嗜冷菌（Psychrotrophics）,后者是目前原料乳中主要活跃的嗜冷菌。国际乳品联合会（International Dairy Federation）所规定的嗜冷菌为：在20℃以下能够生长繁殖，且最适生长温度在10~15℃的一类微生物[2

]。

正因为嗜冷菌种类繁多，目前仍然只能一次对其中少部分嗜冷菌进行特异性快速检测，并且检测结果存在“假阳性”的情况，导致检测结果不够准确[3-4]。不同地区的原料乳样品中嗜冷菌优势菌群也不尽相同，这使得快检技术无法对原料乳中嗜冷菌进行全面检测。在运输储藏期间嗜冷菌不断产生无法通过巴氏灭菌和超高温灭菌完全去除的耐高温蛋白酶和耐高温脂肪酶，导致乳制品在货架期内出现结块、变苦、凝乳等现象，严重影响乳制品品质[5]。

分析掌握原料乳中优势菌群是建立具有普遍性、针对性检测和控制技术的前提。本文综述了目前原料乳中嗜冷菌的菌群多样性影响因素、可能来源和原料乳嗜冷菌菌群分析常用的方法技术。

1 原料乳中嗜冷菌多样性影响因素

原料乳中嗜冷菌主要包括γ-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、放线菌纲（Actinobacteria）以及占比不高的α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）、β-变形杆菌纲（Betaproteobacteria）、黄杆菌纲（Flavobacteria）和鞘脂杆菌纲（Sphingobacteria），每个纲有20个左右菌种[6]。Nuwan等人[7]总共分离鉴定了927株菌株，其中19.9%为假单胞菌属，13.3%为芽孢杆菌属，5.3%为微杆菌属，8.6%为乳球菌属，4.9%为不动杆菌属，2.8%为哈夫尼菌属，还有相当大一部分菌为迄今未知的种属。2017年，Yuan等人[8]从中国11个城市的不同牧场采集的原料乳中分离鉴定了480株菌株，归属于24个属和74个种，所有分离菌株中假单胞菌属最多，占比58.8%，其次为不动杆菌属、黄杆菌属和鞘脂杆菌属，分别占比为13.3%、6.0%、4.2%，其中包括了12.3%的菌株是未知的。来源不同的原料乳样品中嗜冷菌菌群结构存在着一定的差异，其多样性主要受到温度、储藏时间、气候、地域和季节等因素影响。

1.1 储藏温度和储藏时间因素

原料乳中嗜冷菌大部分属于兼性嗜冷菌，其最适生长温度高于15℃，在4~12℃之间温度越高则越有利于原料乳中的嗜冷菌生长[9]。所以在原料乳运输、储藏阶段，如果没有控制好合适的温度，嗜冷菌便会大量生长繁殖产生水解酶进而破坏原料乳的品质。目前我国冷链运输的技术并没有达到非常成熟的阶段，并非所有牧场都能保证原料乳的运输、装罐时将温度控制在6℃，以及将牧场储奶罐控制在3.5℃[10]。

Paludetti等人[11]发现当牛奶在2℃下储藏96 h后，嗜冷菌的数量从4.34 log CFU/mL增加到了6.44 log CFU/mL，在4℃下储藏72 h后，嗜冷菌的数量则更多，与前者相比存在显著性差异。尽管这些变化不至于对牛奶成分和加工参数产生明显的影响，但仍说明温度和储藏时间对嗜冷菌菌群有着极大的影响。Karlsson等人[12]的研究报道，UHT乳在4℃和20℃条件下保质期可达到34~36周，然而在30℃和37℃条件下保质期则会缩短至16~20周，并且有明显的沉淀形成以及口感和色泽的变化。Ribeiro等[13]分析巴西地区原料乳，发现样品中平均嗜冷菌数量为1.1×104CFU/mL，并且存在大量具有产蛋白水解酶能力的菌株，其中乳酸乳球菌、神户肠杆菌、解脲沙雷氏菌、尿气球菌和地衣芽孢杆菌的丰度较高，经过分析发现，47.8%和29.8%的分离菌株分别在35℃下48 h内和7℃下10 d内出现了腐败能力。所以应当尽量减少原料乳储藏时间，尽快进行灭菌处理，防止嗜冷菌产生大量水解酶而破坏原料乳品质。

1.2 地域因素

不同地区的环境中相对湿度、温度和光照条件并不相同，而且各个牧场的管理条件和方式不一样，原料乳中的微生物大多来自外界环境，因此不同地区的原料乳中嗜冷菌菌群也存在一定的差异。

李建洲等人[14]通过对新疆乌昌地区和喀什地区的多个牧场环境研究分析，发现两地区环境中嗜冷菌种类存在明显差异，在卧床土、饲料、空气和管道口中，嗜冷菌种类丰度在乌昌地区显著高于喀什地区，在乳牛乳头部位、奶罐口和混奶中，嗜冷菌种类丰度则是喀什地区显著高于乌昌地区。2016年，Liang等人[15]利用PCR-DGGE技术分析了中国北部3个地区的原料乳样品，发现3个地区的嗜冷菌优势菌群存在相同的菌属，如假单胞菌属和乳杆菌属，但菌群结构有着明显的差异，不同地区样品中假单胞菌相对丰度最低为20.39%，而最高可达到41.83%；乳杆菌相对丰度最低为21.50%，最高则有41.55%，但作者并未进行溯源分析。Siv等[16]研究了挪威两个不同地区原料乳中微生物菌群，结果在检测出的15个丰度最高的菌属中，有7个菌属丰度在两个地区间存在显著差异，尤其是芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属，B地区75%样品中检测出了芽孢杆菌属细菌，而A地区所有样品都检出了，类芽孢杆菌属检出率在A和B地区样品检出率分别为32%和68%。

1.3 季节因素

不同的季节会影响原料乳中嗜冷菌的数量，其数值介于1×102~1×107CFU/mL之间浮动[17]。研究发现韩国京畿省的原料乳样品在冬季的嗜冷菌数量高于其他季节，达到了3×104CFU/mL，与其他季节存在着显著差异[18]。Kable等[19]利用高通量测序研究了美国加利福尼亚圣华金谷春夏秋3个季节的899辆油罐车中的原料乳菌群多样性，发现样品中菌群多样性存在季节性的差异，春季原料乳样品中微生物多样性最为丰富，其中放线菌纲丰度最高，但在这些菌群结构复杂的原料乳中仍然存在核心菌群，包含了以链球菌属、葡萄球菌属以及未鉴定的梭菌属为主的29个OUTs。Li等[20]发现，中国上海地区6月原料乳中微生物菌群多样性最为丰富，12月则相对较低，总体上存在优势菌群群体，门水平以厚壁菌门、变形菌门和放线菌门为主，且呈动态平衡关系；属水平以假单胞菌属、不动杆菌属和乳球菌属为主。研究表明不同季节的温度和湿度决定了原料乳中微生物菌群的多样性，低温季节时相对丰度最高的是放线菌门，高温季节则是以厚壁菌门为主。Yang等[21]研究表明，中国黑龙江省的原料乳中嗜冷菌数量在夏季显著高于冬季，嗜冷菌数量随季节变化而波动，其数量介于2.80 log CFU/mL到5.58 log CFU/mL之间，夏季原料乳中优势菌群主要是肠球菌属、肠杆菌属和紫色杆菌属，占比分别为15.6%、13.7%和9.1%，冬季原料乳中优势菌群以短波单胞菌属、不动杆菌属以及鞘氨醇单胞菌属为主，分别占14.6%、13.2%和13.2%，结果表明嗜冷菌的浓度和菌群结构随季节变化显著。

总而言之，原料乳中微生物的多样性在一定程度上受到季节的影响。掌握原料乳中不同季节的菌群结构以及其中主要危害菌，能够为奶业和相关部门制定相应措施提供一定的参考价值。

2 原料乳中嗜冷菌可能的来源

原料乳中嗜冷菌污染来源途径很多，因为嗜冷菌在自然界中分布极广，同时还存在很多人为因素。挤奶设备未及时清理、挤奶工人不良习惯、奶牛身体不健康以及牧场的不规范管理等都会成为原料乳受到嗜冷菌污染的因素之一。

Conor等[22]研究表明，奶牛的放牧方式（即室内放牧或室外放牧）不同会造成原料乳中微生物菌群多样性的不同，同时发现原料乳微生物菌群与乳头拭子样品和粪便样品之间有着明显的相似性。通过溯源分析发现，奶牛乳头表面为最主要污染源，其次是粪便。Ana等[23]分析巴西伯南布哥州质量较差的原料乳，发现原料乳中嗜温需氧菌、嗜冷菌、凝固酶阳性葡萄球菌和大肠杆菌的数量分别达到了8.3×106、2.6×107、1.3×104CFU/mL和3.7×103CFU/mL，在原料乳散装罐中这些细菌的数量同样如此，甚至更高。作者经过溯源分析发现，罐的残留水、罐底部、散装罐内、奶牛乳头、挤奶工具、桶和挤奶工的手都是污染源，但主要污染的原因还是挤奶过程中的不当操作或者不良习惯。Magnusson等[24]通过随机扩增多态性DNA对原料乳中蜡状芽孢杆菌芽孢溯源分析，在挤奶设备冲洗水中检测到了每升322个孢子数，牛圈垫料中检测到了高达每克8.7×103个孢子数量，且垫料孢子数量与原料乳中孢子数量成正相关，表明牛圈所使用的料垫是主要的污染源。

3 原料乳中嗜冷菌多样性分析方法

3.1 传统方法

传统方法主要是依靠培养基的培养、分离、纯化、鉴定，主要是根据菌体的形态特征、革兰氏染色、生理生化反应等对嗜冷菌进行鉴定[25]。在现代分子生物学技术出现之前，这是对微生物分析的唯一方法。参照国标SN/T 2552.4-2010[26]和NY/T 1331-2007[27]，对于原料乳中嗜冷菌的计数方法可分为2种，一种为6.5℃条件下培养10 d后计数，另一种为21℃条件下培养25 h后计数。但这两种方法培养后的计数结果有显著差异并且没有相关性，所以21℃增菌培养的方法并不能替代标准的6.5℃培养方法[28]。这在一定程度上延长了实验周期。

传统方法一直沿用至今，尽管可以达到菌群多样性分析的目的，但单纯基于此方法分析所得到的结果并不全面。目前能够在实验室培养的微生物只有不到1%，绝大部分细菌处于一种“存活而不可培养”状态[29]。传统方法的优点是能够将分离菌株鉴定到种，但因嗜冷菌包含多种不同的细菌，这便暴露了这种方法的短板：工作量巨大并且费时；得到的结果不够全面，无法对原料乳中嗜冷菌菌群进行全面的分析。

3.2 现代分子生物学方法

因为传统方法存在缺陷以及科技的不断发展，现代分子生物学方法应运而生。目前在原料乳嗜冷菌菌群分析方面使用较为普遍的高通量测序、随机扩增多态性DNA和PCR-DGGE技术。

3.2.1 高通量测序

高通量测序技术（High-throughput sequencing,HTS）又被称为“下一代”测序技术（”Next-generation”sequenccing technology，NGS）。以美国罗氏公司所研发的454测序仪、美英合作研发的Illumina测序仪以及美国ABI公司研发的SOLiD测序仪作为代表，这些测序仪都是采用循环芯片测序法（Cyclic-array sequencing）。此方法的原理简单来说就是将所需测序的DNA样品填满在特制的芯片上，不断地进行PCR反应和荧光序列读取。实验步骤主要分为样品分析、文库构建、测序反应、数据分析[30]。

2020年，Russo等人[31]通过高通量测序技术分析了在4℃保存3天后的驴原料乳中微生物菌群，最终将49624个测序样品分为387个OTUs，分析发现主要菌群大部分属于假单胞菌属，占比高达93%，并在样品中发现了两类对原料乳安全性有中等影响的危害菌。虽然危险系数不高，但是考虑到主要消费群体为婴儿、老人以及免疫力低下人群，相关部门以及生产企业应当引起重视。雷鸣等[32]通过16SrRNA高通量测序分别分析在4、10、15℃储藏一定时间后原料乳中嗜冷菌和细菌的多样性，发现4℃条件下储藏一天后原料乳中嗜冷菌数占比高达总菌数的90%，其中黄杆菌属的相对丰度最高，为47.66%，假单胞菌属以39.54%的占比紧随其后；而在10℃和15℃下分别储藏72 h和24 h后，细菌总数超过了国标规定数量。尽管国标没有对原料乳中嗜冷菌数量进行明确规定，但一部分嗜冷菌能够产耐高温蛋白酶和耐高温脂肪酶，这将导致原料乳的品质受到影响，使得乳制品货架期缩短[33]。这表明嗜冷菌在原料乳储藏运输过程中应当严格控制温度，尽可能快的对原料乳进行加工处理，缩短存放时间。

高通量测序有着如下优点：在不需要培养的情况下，直接对样品进行测序分析，可培养微生物和不可培养微生物都能够被检测分析，相较于传统培养方法，高通量测序操作简单、节省时间、大大减少了实验的工作量的同时，更加提高了所获取数据的准确性，通过测序分析基本可以涵盖样品中所有微生物菌群；成本相对较低；测序量大、速度快，能够同时对几十万乃至更多序列进行测序分析，然而高通量测序只能得到样品中微生物的相对丰度，难以区分物种OTU。

3.2.2 随机扩增多态性DNA

随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术是一种基于PCR建立的技术，于1990年由Williams等人提出[34]。此技术通过设计随机的引物对样品DNA进行PCR扩增，随后PCR产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳处理，以EB染色后检测分析研究样品DNA的多样性。

Martins等[35]使用RAPD技术研究了从冷藏生乳中分离出的70株嗜冷菌的多样性，结果发现扩增出的多态性片段较多，随后作者通过Jaccrad系数计算遗传距离，其结果从11.76%到100%不等，这表明分离株之间存在巨大的遗传变性。此方法不仅可以用来研究菌群的遗传多样性，还可以对污染物进行溯源。Eneroth等人[36]通过RAPD技术在瑞士或挪威的3个牧场中寻找污染源，最终从生奶、巴氏杀菌奶、空气、水源和包装罐中检测到了与污染样品中革兰氏阴性嗜冷菌一致的RAPD类型，大部分污染菌归类于假单胞菌属。

RAPD技术在各个领域也已经被广泛运用，主要因为有着以下这些优点：仅需加单个引物，扩增时无特异性；有较高的检出率；无需专门设计扩增引物；所需样品DNA样品极少；技术简单、省时省力。然而这种技术也存在一定的缺陷：重复性和可靠性都不够高，因为容易受到反应条件的影响，如Mg2+离子的浓度、聚合酶的来源等；电泳过程中存在共迁移的问题，导致不能区分出长度相同而碱基序列不同的片段。

3.2.3 变性梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）是近些年在微生物菌群分析方面较为热门的一种技术。此技术是通过在聚丙烯酰胺凝胶电泳中加入梯度变性剂，根据不同的DNA片段因其碱基含量不同而造成的双链结合力不同，不同的DNA片段在变性剂中出现不同的部分解链，随后这些片段因为迁移率的改变而被区分开来，被区分开的条带便可通过回收测序和DGGE图谱计算得出微生物菌群多样性。此技术主要操作流程如下：总DNA提取；16S rDNA或功能基因片段的PCR扩增；DGGE电泳；切胶回收后测序；微生物多样性分析等。

Eric等[37]通过PCR-DGGE技术检测了分别CO2、热杀菌、微过滤处理后和不处理的原料乳在冷藏过程中微生物的多样性变化，研究发现原料乳中主要菌群为链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属和气球菌属，在原料乳冷藏7天后，假单胞菌属是CO2处理和未处理原料乳中的主要菌群，而在热处理和微过滤原料乳中的主要菌群为葡萄球菌属和寡养单胞菌属。这说明不同的处理方式能够在一定程度上影响原料乳中微生物菌群结构，但作者并没有对菌群的数量做进一步的分析。2013年，唐玲等[38]用PCR-DGGE技术分析原料乳中主要的污染菌群，检测出了以猪链球菌、马肠链球菌和乳酸链球菌为主的12种菌群。除了菌群分析，此技术同样可以进行污染溯源分析。周国君等[39]通过PCR-DGGE技术对巴氏灭菌乳中腐败菌进行溯源，发现原料乳容易在挤乳、包装环节发生污染。

PCR-DGGE技术因其高效性和可靠性等而被广泛运用于食品行业微生物菌群分析和污染溯源，同时这种方法不依赖于培养，能够较为全面的反应样品中的微生物菌群结构。但此技术对样品处理方式、DNA纯度和反应条件等要求非常高，同时电泳过程中存在共迁移问题，且无法检测出菌体浓度过低的菌群[40]。

4 结果与展望

如果能够将各地区嗜冷菌菌群研究透彻并分析出主要危害菌群，将对奶厂控制污染源以及相关部门实施相应检测控制措施提供很大的帮助。随着HACCP体系的建立和推行，牧场的管理体系也不断完善，但是如何在“农场到餐桌”的过程中落实到每一个点以及规范奶农的操作仍然有待解决。

如今，通过不依赖培养的方式对菌群进行多样性分析越来越被学术界所认可，这也使得现代分子生物学技术的应用得到了快速的发展。但对于原料乳中嗜冷菌的菌群多样性分析，将传统培养方法与现代分子生物学技术相结合或许是目前更为合理的方案，对原料乳中大部分嗜冷菌快速检测和有效的控制仍然是乳制品行业的一大挑战。但随着现代分子生物学技术发展和对嗜冷菌研究的不断深入，原料乳中嗜冷菌的检测和控制一定能得到解决。