软枣猕猴桃不定根总黄酮提取工艺的优化

吴晓晗，李学峰，范明智，廉美兰，金美玉

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)属猕猴桃科，是多年生藤本植物，最早记载于《开宝本草》，在日本、俄罗斯和我国东北南部山区较为常见[1-3]。随着对软枣猕猴桃根的相关药理活性的不断深入研究，发现其提取物富含大量有效活性物质，如萜类、多糖类、生物碱类、黄酮类、多酚类等[4-5]，其中，含量最高的是黄酮类化合物。黄酮类化合物结构类型复杂多样[6]，数量种类繁多，对植物的生长和发育起着至关重要的作用[7]，具有抗炎、抗氧化、提高免疫力的药理功效[8]，特别对治疗癌症应用更多，因此，备受国内外学者的关注，成为研究和开发利用的热点[9]。近年来对总黄酮的提取方法种类繁多，但其存在能耗高、效率低、提取不充分等缺点，同时，利用不同提取条件提取的软枣猕猴桃根总黄酮含量的影响也很大[10]。通过对植物提取条件的筛选，可有效提高植物体内总黄酮含量的积累。延永等[11]利用碱液提取法、热水提取法、乙醇回流提取法、超声提取法、微波提取法等5种方法提取了苦丁茶中的总黄酮，研究发现乙醇超声提取法提取黄酮的效率远高于其他；贾凌云等[12]利用紫外分光光度法对总黄酮提取方式进行系统研究，结果发现用乙醇回流法效果最好，且用14倍量95%乙醇回流提取菊花中的总黄酮可以获得较高的提取率；孟永海等[13]为了更高效的提取出刺玫果中的总黄酮，采用正交试验设计优化了刺玫果总黄酮的提取工艺，发现正交试验不仅实验次数少，而且数据点均匀分布。目前，软枣猕猴桃根的人工栽培技术并不完善，不能快速生产大量的软枣猕猴桃植物资源以满足市场的供应[14]，而通过生物反应器培养大量植物资源已经成为目前研究的热点与重点。生物反应器培养具有条件控制方便、体积大、生产能力高等优点[15]，并且可以为生物体生长提供良好的生物活性环境，达到最佳生长状态，使其生物量或目标产物达到最高的工程设备[16]。因此，该实验以生物反应器培养的软枣猕猴桃不定根为试验材料，探讨在不同提取工艺下对软枣猕猴桃不定根中总黄酮含量的影响，为今后软枣猕猴桃根的黄酮类化合物的开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

软枣猕猴桃组培苗由延边大学农学院提供。将软枣猕猴桃组培苗的根切至1 cm，接种于含25 mL培养基 ( MS+IBA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g，pH值5.8 )的培养皿中诱导不定根。将诱导出的不定根接种于含4 L培养基(MS+IBA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L)的5 L气球型生物反应器中进行培养。生物反应器培养的通气量调节为100 mL/min，在25 ℃下暗培养。30 d后收获不定根，在流水下冲洗3次，去除表面水分后置于45 ℃恒温烘干箱中烘至恒重(48 h)，将其作为试验材料。

1.2 仪器与药品

JA2002电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；THC-58型数控超声提取机(中国济宁天华超声电子仪器有限公司)；R201D旋转蒸发仪(中国上海申顺生物科技有限公司)；YHW-1103远红外鼓风干燥箱(中国天津市华北实验仪器有限公司)；UV1102紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；芦丁标准品购于Sigma试剂有限公司，其他试剂购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 软枣猕猴桃不定根提取物的制备

取软枣猕猴桃根干品2 g，置于150 mL三角烧瓶内，用正丁醇、甲醇、乙醇和水4种不同溶剂，利用超声提取法，按照1∶30(g∶mL)料液比进行提取，在50 ℃和40 kHz的频率下进行提取，1 h 后过滤，重复2次，合并滤液，将滤液置于旋转蒸发仪内真空浓缩，将浓缩后的膏状物置于烘干箱中45 ℃下干燥至恒重，收集烘干后的不同溶剂提取物，置于冰箱保存备用。

1.3.2 软枣猕猴桃不定根提取物总黄酮含量的测定方法

利用硝酸铝比色法测定软枣猕猴桃不定根提取物的总黄酮含量[17]。精确称取10 mg芦丁至烧杯内，加入70%乙醇溶液溶解后定容至250 mL，即浓度为40 μg/mL。

分别吸取上述溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，用75%的乙醇定容至2 mL，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液摇匀后室温下静置6 min，加入3 mL 10% Al(OH)3溶液静置6 min后加入2.0 mL 4% NaOH溶液，分光光度计510 nm处测定吸光值，绘制相应的标准曲线，得回归方程为：y=3.414 7 x+0.002 2,R2=0.992 5。精密称取0.01 g软枣猕猴桃不定根提取物，用75%乙醇溶解后定容至25 mL，每个样品取0.4 mL于试管中，用75%乙醇定容至2 mL，即为待测样品溶液。按标准曲线步骤操作，测定吸光值，并计算总黄酮含量。

黄酮含量/mg·g-1=CVD/m

式中，C为样品溶液浓度/mg·mL-1；V为样品溶液体积/mL；D为稀释倍数总黄酮含量；m为样品质量。

1.3.3 软枣猕猴桃不定根提取物提取工艺的优化

1) 单因素试验 ①乙醇浓度试验：将乙醇浓度设置为25%，50%，75%，100%，在50 ℃，料液比 1∶30(g∶ mL)的条件下提取2次，其他提取物提取方法同1.3.1；②提取时间试验：选取总黄酮含量较高的乙醇浓度，将提取时间设置为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，在50 ℃，料液比1∶30(g∶mL)的条件下提取2次，其他提取物提取方法同1.3.1；③提取温度试验：以提取时间试验中总黄酮含量较高的乙醇浓度、时间作为提取条件，将提取温度分别设置为30，50，70与90 ℃，料液比1∶30(g∶ mL)的条件下提取2次，其他提取物提取方法同1.3.1；④提取次数试验：以提取温度试验中总黄酮含量较高的乙醇浓度，时间以及温度作为提取条件，将提取次数分别设置为1，2，3和4次，在料液比1∶30(g∶ mL)，温度50℃的条件下提取，其他提取物提取方法同1.3.1；⑤料液比试验：以提取次数试验中总黄酮含量较高的乙醇浓度、时间、温度以及次数作为提取条件，将料液比设置为1∶20，1∶30，1∶40与 1∶50(g∶mL)，在50℃条件下提取2次，其他提取物制备方法同1.3.1。

2) 正交试验设计 参照上述单因素试验结果，选不同提取时间、温度、次数以及料液比4个单因素，以不定根提取物中总黄酮的含量作为指标，设定4因素3水平L(34)正交试验(表1)，确定最佳的提取工艺。然后根据正交试验中最佳提取工艺的条件，对其进行重复3次的验证试验，以此确定该条件是否具有稳定性。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of L9(34)

3) 验证试验 根据正交试验中最佳提取条件的结果，对其进行验证试验，重复3次，确定该条件是否具有稳定性。

1.3.4 数据分析

该试验中利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)对试验数据进行分析，用邓肯氏新复极差法作对比，显著水平为0.05，每个处理均进行3次重复试验。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂对总黄酮含量的影响

软枣猕猴桃不定根干粉分别用正丁醇、甲醇、乙醇和水提取后测定总黄酮含量，发现在乙醇和正丁醇提取物中，总黄酮含量较高，2种间无显著性差异(图1)。水和甲醇提取物中总黄酮含量较低，因此，不适宜作为提取溶剂。而与正丁醇比较，乙醇价格低廉，所以选用乙醇作为软枣猕猴桃不定根黄酮的提取较为适宜。

2.2 提取浓度对总黄酮含量的影响

由图2可知，当提取溶剂浓度低于75%时，其黄酮含量随之升高；提取溶剂浓度达到75%以上，其黄酮含量随浓度升高逐渐下降。因此，最佳提取溶剂浓度为75%，此时不定根中黄酮的含量最高，为123.64 mg/g。

2.3 提取时间对总黄酮含量的影响

在提取时间从0.5 h上升到2 h过程中，总黄酮的含量呈现先上升的趋势，当提取时间为1.5 h时，总黄酮含量达到最高,为131.25 mg/g(图3),但当时间大于1.5 h时，提取物总黄酮含量显著降低。所以，选择最佳的提取时间为1.5 h。

2.4 提取温度对总黄酮含量的影响

由图4可知，温度从30 ℃ 升高至50 ℃ 时，提取物中总黄酮的含量增加，在温度为50 ℃时，总黄酮含量最高，达到135.59 mg/g(图4)，但当温度大于50 ℃时，提取物中总黄酮含量显著下降。因此，以50 ℃提取软枣猕猴桃不定根中黄酮较为适宜。

2.5 提取次数对总黄酮含量的影响

当提取次数为1～3次时，不定根中总黄酮的含量增加；提取次数达到3次以上，其总黄酮含量表现出下降趋势。因此，提取次数在3次时，其总黄酮含量达到最高，为134.92 mg/g(图5)。

2.6 不同料液比对总黄酮含量的影响

在提取试验中，料液比是指提取物干重与溶剂体积之比。当料液比从1∶20增加到1∶30时，总黄酮的含量大幅升高，达到132.32 mg/g(图6)，但料液比超过1∶40时，总黄酮的含量依次降低。因此，适宜的料液比选定为1∶30。

2.7 正交试验

根据上述单因素试验结果，设定L9(33)正交试验方案，对提取时间、提取温度、提取次数、提取料液比4个因素进行不同组合，探究了不同提取组合总黄酮含量的影响，正交试验方案及结果见表2。通过极差值(R)进行分析的结果，温度 >料液比 >次数 >时间，结果表明在正交实验中提取温度对总黄酮含量的影响最大，其次为提取料液比。其中,2号组合即提取时间1 h、提取温度50 ℃、提取次数3次、料液比为1∶30(g∶mL)时，总黄酮含量最高，达到142.28 mg/g。分别计算出各因素水平对总黄酮含量的平均值K，经分析发现提取时间(A)中K1值最大，提取温度(B)、提取次数(C)和料液比(D)中K2值最大。综上所述，最适宜的工艺条件为A1B2C2D2，即，提取时间1 h、提取温度50 ℃、提取次数3次、料液比1∶30(g∶mL)。

表2 正交试验方案及结果Table 2 Orthogonal experiment and result

2.8 验证试验

为确定最优提取工艺是否具有稳定性，对表2正交试验中得到最佳提取条件即提取时间1 h、提取温度50 ℃、提取次数3次、料液比1∶30(g∶mL)，进行3次重复验证试验，结果发现验证试验结果的相对标准偏差(RSD)值较小，为1.93%(表3)，表明正交试验所选出的最优提取条件具有较好的稳定性。

表3 验证试验结果Table 3 Verification of test results

3 讨论与结论

近年来，由于对软枣猕猴桃根的大量采集，导致其野生资源逐渐稀少，直接影响了软枣猕猴桃根的研究与利用[18]。而通过生物反应器可以大量培养植物细胞、组织或器官，目前已应用于金线莲、高山红景天等多种植物培养中。通过生物反应器培养的软枣猕猴桃根具有抗炎、抗癌以及抗氧化等多种功效[19]。其含有的黄酮类化合物具有很好的抗氧化效果，可以清除体内自由基，延缓衰老，减少癌症的发生，成为保健品和化妆品的研发热点。而相关研究表明，不同的提取工艺也很大的影响着黄酮类化合物的含量。马微等[20]采用加热回流提取、超声波提取和热回流辅助超声波提取3种不同方法对冬虫夏草进行提取，结果发现含超声方式所制得的提取液的稳定性和均一性较好，提取到的生物活性化合物种类更多；王秀敏等[21]在提取乌饭树叶中的黄酮含量时，分别用甲醇，乙醇，丙酮，正己烷和蒸馏水进行提取，筛选发现当提取溶剂为甲醇时竹叶内黄酮含量达到最高；陈宇等[22]对竹叶黄酮的提取工艺进行优化，结果显示当乙醇浓度60%，料液比1∶25，超声时间为1 h时，黄酮含量达到最高。该研究选取软枣猕猴桃不定根作为试验材料，筛选出最佳提取溶剂、浓度、提取时间、温度和次数，利用硝酸铝比色法对软枣猕猴桃不定根不同溶剂提取物中总黄酮的含量进行测定，根据单因素试验结果进行正交设计并进行验证。结果发现，软枣猕猴桃不定根最佳提取溶剂为乙醇，最佳提取浓度75%，根据正交实验结果得出的最优提取工艺组合为提取时间1 h、提取温度50 ℃、提取3次，经3次重复性验证试验后，总黄酮含量达到149.97 mg/g，相对标准偏差1.93%。