花生RAPD反应体系的优化及其遗传多样性分析

徐 彪，冯艺川，李玉发，何中国，吴松权*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133000；2.吉林省农业科学院，吉林 公主岭 136110)

花生(ArachishypogaeaLinn.)是吉林省重要的油料作物和经济作物，也是吉林省西部地区主栽的旱田作物之一。由于特殊的气候条件，吉林省花生品质好，口感佳，特别是黄曲霉污染较低[1]。但吉林省花生新育成品种遗传基础狭窄，品种退化，专用品种少等问题严重影响吉林省花生产业的发展[1-2]。因此，开展新型分子标记技术，科学合理地分析、利用吉林省花生种质资源，有利于更好更快地建立花生良种繁育体系，有助于加快专用型花生品种的选育和引进[1-2]。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)是一种基于聚合酶链式反应，以10核苷酸的随机序列，扩增所研究材料的基因组DNA分子标记技术[3-4]。由Williams和Welsh于1990年几乎同时提出和建立[5-6]。与其它标记相比，RAPD既不需要DNA探针，也不需要序列的信息；并且RAPD扩增程序不涉及DNA杂交及其相关步骤，操作简单和高效；与RFLP标记相比，RAPD能检测到更高的多态性；另外，RAPD扩增的产物可以克隆、测序、转化为其他类型的标记，如序列标签位点(STS)、序列特异扩增区域(SCAR)标记等优点[4]，广泛应用于遗传多样性分析。马孟莉等[7]利用11个RAPD引物对48份草果分为4类；王同华等[8]应用RAPD和ISSR分子标记技术对湖南省饭豆地方品种进行了遗传多样性研究，遗传相似性系数在0.649～0.876 5之间；朱学鑫等[9]采用RAPD标记研究了国内不同产地白及的遗传多样性和亲缘关系，在遗传相似性系数为0.58处分为2类。以上结果表明，RAPD分子标记在不同的物种中均能够很好的反应品种(材料)间的遗传变异，可用于花生遗传多样性分析。

为了进一步系统的采用RAPD分子标记技术研究花生的遗传多样性和花生品种间遗传距离。该文利用2×Taq PCR Mix酶的快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，首先对花生RAPD-PCR反应体系进行优化，之后使用优化后的反应体条件对22个花生品种进行遗传多样性分析，对提高花生新品种选育和遗传改良效率均具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 植物材料

来源于吉林省农业科学院花生研究所收集的22份花生种质资源(表1)，取15 d花生幼苗嫩叶为试验材料。

表1 花生种质资源名称Table 1 Name of germplasm resources of A.hypogaea

1.2 基因组DNA提取及检测

采用BIOMIGA公司Ezgene TM CP Plant Miniprep Kit(GD2621)的方法，提取花生基因组DNA，用超微量分光光度计和琼脂糖电泳进行检测，将总DNA稀释为10 ng/μL，置于-20 ℃ 保存备用。

1.3 PCR扩增及检测

PCR预扩增程序为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，35～40 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环次数36～40次；12 ℃保存。扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，经Gold View Ⅰ型核酸染色剂染色后在凝胶分子成像仪器(JY04S-3E型)成像保存。

1.4 随机引物的筛选

以多个地理来源的科富花1、花育20、吉花9、双辽红粒、白院花8、铁花16等量均匀混合的花生DNA为模板，对200个随机引物进行筛选。最后选择多态性高，重复性好的24个引物，用于后续试验。其中，引物OPJ-14(5'-CACCCGGATG-3')在花生基因组总DNA中扩增条带比较均匀、清楚。因此，该研究中选用引物OPJ-14进行优化试验。

1.5 RAPD反应体系的单因素优化设计

选用混合后的花生DNA作为反应体系优化的模板，以引物OPJ-14对影响反应的4个主要因素(退火温度、循环次数、引物和模板DNA)进行单因素优化分析，各因素设置如下：退火温度为35、36、37、38 、39、40 ℃；循环次数为36、37、38、39、40；引物浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 pmol；模板DNA浓度为10、15、20、25、30 ng。保持其他因素不变，其中单一因素浓度改变，筛选最适合的浓度，以获得最佳的反应体系。

1.6 数据处理

根据电泳图谱，以0、1统计RAPD带型，在相同迁移位置上有条带计为“1”，无条带计为“0”，条带缺失计为“9”，建立二维矩阵，用Microsoft Excel 2017处理相应数据，并根据分析软件的文本格式进行相应转化。使用NTSYS-pc Version 2.1软件进行计算遗传相似系数，最后使用UPGMA的方法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA浓度及质量检测

该试验采用BIOMIGA公司试剂盒提取花生DNA，琼脂糖凝胶电泳检测表明，DNA条带清晰、明亮无拖尾现象(图1)。OD260/OD280值介于1.8～2.0。纯度较高，可进一步用于RAPD扩增。

2.2 RAPD反应体系的单因素优化

2.2.1 退火温度与循环次数筛选

退火温度筛选试验结果(图2)，退火温度为35～40 ℃时，均能扩增出条带，在36 ℃时，条带最清晰，因此，退火温度采用36 ℃。循环次数为36～40时，均能扩增出条带(图3)，其中，循环次数为38时，条带最清晰，因此，循环次数采用38。

2.2.2 引物浓度与模板DNA浓度筛选

通过PCR扩增反应筛选最佳引物浓度的试验结果(图4)显示，引物浓度为0.1和0.2 pmol时，扩增条带模糊，有条带缺失，而引物浓度为0.4和0.5 pmol时，扩增条带最清晰，因此，引物浓度选用0.4 pmol最为适宜。最佳模板DNA浓度筛选试验结果(图5)显示，反应中这5种浓度梯度上均能扩增出条带，模板浓度为10和15 ng时，扩增条带亮度较弱，在20、25和30 ng扩增产物条带最为清晰，结果一致，因此，模板DNA浓度选20 ng最为适宜。

2.3 引物筛选与RAPD标记多态性分析

以22份来自不同地区的花生品种为试验材料，从200个随机引物中筛选出24个条带清晰、多态性高且重复性好的引物(表2)，用于花生遗传多样性分析。24个引物共扩增得到134个稳定条带，多态性条带112个，多态性比率83.58%；每个引物扩增条带数为3～9条，平均每个引物产生多态性条带数为4.667条，其中，OPB-10扩增的条带数最多，为9条；扩增引物多态性比率为100%的为OPB-10、OPB-13、OPC-07、OPD-05、OPH-11、OPI-08、OPJ-01，图6为引物OPG-11扩增结果。

表2 24条多态性引物扩增结果Table 2 Amplification results of 24 polymorphic primers

2.4 聚类分析结果

用NTSYS-pc Version 2.1软件计算花生品种遗传相似性系数(表3)表明：22个花生品种的平均遗传相似系数为0.697，不同品种之间遗传相似系数的范围为0.385～0.969，其中，铁花16、锦花30与吉黑花1号的遗传相似性系数最小，为0.385，关系最远。吉花53与吉花54遗传相似性系数最大，为0.969，关系最近，可能来源于同一父母本。根据供试材料相似值，采用UPGMA方法进行聚类分析，在遗传相似系数为0.666时，供试材料可分为3大类(图7)，其中，第1大类主要以吉林省选育的花生品种为主，第2大类以引进其它省份的花生品种为主，第3类包括两个品种白院花10和锦花14。

表3 22份花生品种遗传相似性系数Table 3 Genetic similarity coefficients of 22 varieties of A.hypogaea

3 讨论与结论

RAPD是90年代发展起来的标记技术，由于操作简单高效等特点，目前已经在很多生物上有报道[10-16]，说明RAPD标记技术是一个可靠有效的方法。RAPD分子标记技术存在低重复性，特异谱带不稳定性，为了让试验数据更加准确，须对反应体系和扩增程序进行优化，为此获得更加准确的数据[17]。叶冰莹等[18]对花生RAPD反应条件dNTPs、MgCl2和Taq酶浓度等做了初步优化，Taq聚合酶类别及用量对随机扩增试验起着至关重要的作用。该试验所用2×Taq Master Mix酶不仅自带蓝色染料且含有DNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶，而且2×Taq Master Mix酶还具有灵敏度高、稳定性好，只需要加入模板DNA和引物即可[19]，不仅减少人为误差，还能节省时间，因此，该研究利用2×Taq Master Mix对花生RAPD-PCR反应体系进行了优化。研究表明，退火温度、PCR循环次数、模板用量与引物用量均会决定扩增效果[20]。在该试验中，退火温度为35～40 ℃时，均能扩增出条带，循环次数和模板DNA浓度筛选试验也具有类似结果，与陈思等[21]研究结果基本一致，对该试验影响最大的为引物用量，引物浓度低则PCR产物较少，过高会产生非特异性扩增[22]。综合以上试验结果,得出适合花生RAPD反应体系为20 μL总反应体积中含2×Taq Mix 10 μL、引物4 μLpmol、模板DNA 20 ng；确立的扩增程序为：PCR扩增程序为95 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；共循环38次。

近年来，关于RAPD标记技术在遗传多样性分析上被广泛应用[23-31]，但在花生上的报道相对较少。Subramanian等[32]采用RAPD技术分析了70份花生种质资源遗传多样性，在48个随机引物中有7个随机引物具有多态性，多态性百分率为7%。姜慧芳等[33]采用RAPD技术对7个不同植物学类型花生种质资源进行了分析，其中，13个引物多态性百分率为21.48%。以上2人的研究结果与该试验结论相类似，但多态性百分率要比该试验低，该研究24个引物多态性百分率为83.58%，遗传相似性系数为0.385～0.969，说明该试验22个花生种质资源具有较丰富的遗传多样性。其中，从分子的角度分析，遗传距离变异幅度越大，表明品种间遗传分化越明显，遗传多样性越高[34]。可以看出，各品种之间遗传差异较广泛，品种资源丰富。闫苗苗等[35]利用RAPD标记对24份花生栽培品种进行遗传多样性分析，其中13个引物共扩增出123个条带，依据Nei-Li系数将供试的24个品种的花生聚为4类。一般来讲，相同地理环境的品种应该聚为一类，并且地理环境与分子标记间存在着一定的联系，遗传变异程度和地理环境的关系一直备受关注[36]。该研究在遗传相似性系数0.666处将供试材料分为3大类(图7)，说明RAPD标记技术完全可以区分22份花生品种。但是，在该试验研究中相同粒型和相同地区并没有聚为一类，也没有表现出遗传距离和地理位置存在联系，与林茂[37]等研究结果基本一致，进一步说明分子标记技术有较高的应用价值。牟书靓等[38]利用农艺性状对花生种质资源进行聚类分析，其中，东北王与双辽红粒在同一个群组中，这与该试验的结果相同。吉花53与吉花54的遗传相似性系数最大，为0.969，亲缘关系最近，没有被明显的区别开，这是由于来自相同的双亲且选育目标完全一致而导致亲缘关系极其相近。铁花16、锦花30与吉黑花1号的遗传相似性系数最小，为0.385，说明亲缘关系最远。