膜荚黄芪异黄酮3′-羟化酶基因的克隆及表达分析

于 洋，哈 洋，赵 洋，洪 国，吴松权，全雪丽

(延边大学农学院，吉林 延吉 133000)

黄芪(Astragalusmembranaceus)是常用的滋补型中药材之一，属于多年生药用草本植物，有着“补气固表圣药”的美称[1]，药用历史已经有2 000多年，是最常用的补气固表药材之一。植物的次生代谢产物在植物维持生命和人类健康中都起着重要作用[2]。黄芪的主要生物活性成分是黄酮类、多糖和皂苷[3]，具有排毒利尿、补气固表、养血健脾、利水脱肿[4]等功效，经常被用来作为利尿剂、止汗剂、免疫增强剂，是癌症治疗的辅助药品。随着黄酮类化合物研究的不断深入，到目前为止，学者已经从黄芪植物中分离出30多种黄酮类化合物[5]，而黄芪异黄酮是最重要的活性成分，是黄芪发挥药用价值的物质基础[6]。毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷是异黄酮主要的成分，是评价黄芪药材品质的标志性化合物[7]。

异黄酮类化合物是主要分布在豆科植物中的苯丙烷类代谢物的一个子类[8]，其中，异黄酮3′-羟化酶(Isoflavone3′-hydroxylase，I3′H)对异黄酮B环3′位置的羟化作用是催化芒柄花素合成毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的关键步骤，在鹰嘴豆的根和叶中均检测到I3′H的生物活性[9]，另外，在大豆中发现了这种酶可以催化大豆苷元的羟基化反应生成3′，4′，7-三羟基异黄酮,但有关于膜荚黄芪AmI3′H基因转录表达与毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累的研究未见报道[10]。该研究利用RACE技术克隆黄芪I3′H基因全长，对其进行生物信息学分析，并利用荧光定量PCR技术和高效液相色谱法研究在黄芪不同器官中AmI3′H表达量和毛蕊异黄酮+毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量之间的关系，为揭示黄芪异黄酮类化合物的生物合成机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

以栽培2年生膜荚黄芪为试验材料，取一部分新鲜的根、茎、叶，用液氮冷冻后保存于-80℃超低温冰箱中，用于总 RNA 提取，测定AmI3′H在不同器官中表达量；另一部分样品于50 ℃的烘干箱中烘干至恒重，用于异黄酮的提取。

1.1.2 主要仪器

高速冷冻离心机(Hitachi)；超低温冰箱(DW-86L388A)；凝胶成像系统(BioDoc-It220)；美国伯乐PCR 基因扩增仪(T100)；荧光定量PCR(Agilent Mx3000P，美国WEALTEC)；电热恒温干燥箱(BAO-250A)、岛津高效液相色谱仪(LC-10ATVP Plus)，旋转蒸发仪(RE-2000B)；低温冷却循环泵(DLSB-5L)；恒温水浴锅(HH-WO)；超净工作台(YJ-VS-2)；高温高压灭菌锅(MJ-78A)；植物试样粉碎机。

1.2 方法

1.2.1 毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定

采用醇提法提取根、茎、叶中的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷，并用高效液相色谱(HPLC)法测定其含量[11]，毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品购自上海融禾医药科技有限公司，质量分数大于98%。

1.2.2 总RNA 提取与 cDNA 合成

采用TRIzol一步法提取总RNA(Invitrogen)，利用超微量分光光度计检测其吸光值[12]。分析其纯度以及浓度，将总RNA稀释成0.5 μg/L，利用反转录试剂盒(Toyobo)合成 cDNA 的第1条链。

1.2.3I3′H基因克隆

引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

根据 GenBank中其他植物的I3′H基因序列的编码区设计1对简并引物AmI3′H-ju1 和AmI3′H-jd1，以合成的cDNA 为模板进行PCR反应，退火温度52 ℃。根据所测得的AmI3′H基因的保守区设计5′-RACE引物AmI3′H-gsp1 和3′-RACE引物AmI3′H-gsp2，按照Clontech 公 司 RACE cDNA说明书进行RACE反应，从膜荚黄芪的cDNA扩增获得RACE序列。根据所测得的I3′H基因CDS序列设计CDS引物AmI3′H-Cu1和AmI3′H-Cd1。针对获得的AmI3′H序列设计了1对荧光定量PCR引物AmI3′H-qu1和AmI3′H-qd1。PCR产物用DNA 凝胶回收试剂盒(Omega)回收以后，克隆到pMD19-T 载体(Takara)，筛选阳性克隆，测序由上海英俊生物有限公司完成并获得I3′H基因序列。

1.2.4 生物信息学分析

分析基因的开放阅读框(ORF)采用 Lasergene软件包中的 EditSeq；预测编码蛋白的分子量和等电点等理化性质采用 Lasergene 软件和 ExPasy 服务器(https://web.expasy.org/protparam/)；预测蛋白跨膜结构域采用在线工具TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)，预测蛋白质二级结构采用在线工具Psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)，预测亚细胞定位情况采用在线工具 TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 和 WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)；预测信号肽采用在线工具 SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；检索同源性氨基酸序列采用在线工具 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.3 数据分析

采用Excel 2019 软件对数据进行整理，利用SPSS 23.0软件进行方差分析，多重比较采用Duncan新复极差法。

2 结果与分析

2.1 AmI3′H的cDNA克隆与编码氨基酸序列分析

以膜荚黄芪根总RNA反转录的 cDNA第1条链为模板，用简并引物 PCR 扩增，获得了1条大约290 bp 的片段。根据I3′H片段设计特异引物进行5′-RACE和3′-RACE扩增，结果分别获得了1条大约427 bp的5′端和1 568 bp的3′端的PCR产 物，并设计CDS引物，PCR扩增结果获得1 518 bp 全长ORF(图 1)，拼接获得了长度为1 804 bp的AmI3′H基因的全长序列(图2)。GenBank 登陆号为KY086290.1。

AmI3′H的cDNA 全长为1 804 bp，开放阅读框的长度1 518 bp，5′非翻译区为49 bp，3′非翻译区为237 bp，polyA 尾为33 bp，推测编码505个氨基酸，A+T含量为57.58%，G+C含量为42.42%。而且，AmI3′H蛋白具有P450蛋白特征的富含脯氨酸的基序(PPGPPTIP)和血红素保守序列(FGLGRRACPG)(图2下划线部分)。

2.2 AmI3′H生物信息学分析

通过 ExPASy 网站分析蛋白质理化性质，结果表明，AmI3′H的蛋白分子式为C2585H4125N705O739S18,分子量为57 481.64 Da，等电点8.24，不稳定系数为42.89，AmI3′H蛋白的总平均亲水性为-0.251，脂肪系数为98.85，亚细胞定位预测表明，AmI3′H定位在膜上。利用 MEGA7 软件的 NJ 法构建I3′H的系统进化树可知(图3)，AmI3′H与豆科植物刺毛黧豆(Mucunapruriens)亲缘关系最近，同属于细胞色素P450家族。虽然系统进化树基本按照不同物种分类，但不同物种氨基酸序列的相似性均在75%～99%，这充分反映了I3′H在豆科植物进化上的保守性和一定的多态性。

2.3 不同部位毛蕊异黄酮+毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量与I3′H表达量差异性分析

分别测定在膜荚黄芪的根、茎、叶中的AmI3′H基因表达量与毛蕊异黄酮+毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量(图4)，结果表明，在膜荚黄芪的根、茎、叶中毛蕊异黄酮+毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量存在显著性差异，其中，叶部高于茎部，根部含量最少，即根<茎<叶。AmI3′H基因在膜荚黄芪的根、茎、叶中均有表达，表达量具有显著性差异。其中，根部表达量最低，茎部的表达量是根部的4.25倍，而叶部表达量是根部的7.65倍，即根<茎<叶。

3 讨论与结论

在黄芪的各个生长阶段，异黄酮类化合物在植物体内不断合成、消耗、降解，异黄酮类化合物的积累在植物不同器官中具有差异性[13]。而黄芪中异黄酮类化合物含量对品质起着至关重要的作用，如何调控黄芪异黄酮类化合物含量正成为研究热点。前人研究中发现，在大豆和鹰嘴豆中存在异黄酮3′-羟化酶促进异黄酮类化合物的合成[14]。但关于膜荚黄芪AmI3′H基因转录表达与毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累的研究未见报道。

该研究完成了对膜荚黄芪异黄酮3′-羟化酶基因的克隆，并对其进行了生物学信息分析。AmI3′H的cDNA 全长1 804 bp，开放阅读框的长度1 518 bp，推测编码505个氨基酸，通过分析发现，AmI3′H蛋白具有富含脯氨酸的基序(PPGPPTIP，位于33～40位置)和血红素保守序列(FGLGRRACPG，位于436～445位置)，与Liu等在苜蓿中发现的I3′H结构相似[15]。此外，还发现AmI3′H蛋白的44～498氨基酸序列为PLN02687结构域，这些都是P450酶一级结构的特征功能[16]。推测AmI3′H蛋白具有P450酶相似的功能。

膜荚黄芪AmI3′H蛋白与豆科植物刺毛黧豆亲缘关系最近，对其进行二级结构分析确定了一个推定的信号肽(MAPLLYYSLLSLAFILTVKIILQIQ，位于1～25位置)，该信号肽在N端含有膜锚定序列(LY YSLLSLAFILTVKIILQI，位于5～24位置)，与豌豆和甘草中的细胞色素P450酶具有相似的结构域[17-18]。Rajeev等[19]在木豆中也发现了类似的酶。Kirsten等[20]在研究中提出，I3′H蛋白与其它P450酶附着在内质网上组成一个“临时工厂”完成苯丙烷代谢的分支途径。

该研究中，AmI3′H的表达水平(图5)与膜荚黄芪毛蕊异黄酮+毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量变化一致。AmI3′H在膜荚黄芪的根、茎、叶中的表达量为根<茎<叶，这与甘草中基因表达量变化一致[16]。前人研究表明，异黄酮类化合物参与植物对生物胁迫和非生物胁迫的防御机制，而I3′H基因的表达与植物的抗性胁迫相关[14]，推测AmI3′H基因的表达与毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的生物合成相关。

该研究从膜荚黄芪中克隆了AmI3′H基因，并对其进行了生物信息学分析，采用高效液相色谱法分析了毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，证明AmI3′H基因的表达与毛蕊异黄酮+毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累趋势一致，从而为黄芪异黄酮类化合物生物合成机制的研究提供了基因资源。