应用灰色关联度法综合评价8个枣品种抗寒性

董梦怡 ，杨植，王振磊，林敏娟 *

（1南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室/塔里木大学植物科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

（2塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

枣（ZizyphusjujubeMill.）原产于我国，又名红枣、大枣、枣子，具有悠久的栽培历史。近年来新疆红枣发展迅速，优良的地理条件和气候环境造就了新疆红枣的优良品质，使得越来越多的消费者青睐新疆红枣。在红枣产业迅猛发展的同时，新疆部分地区也出现了因忽视气候条件的适宜性而盲目扩大种植规模，或种植区域不合理的状况，从而导致红枣遭受冻害、低温冷害等气象灾害的事件发生，严重影响了红枣的产量和品质［1−4］。本文以骏枣、灰枣、赞晶、冬枣、大白铃、伏脆蜜、蜂蜜罐、永城长红8个品种的一年生枝条为材料。对不同红枣的一年生枝条进行低温胁迫后的渗透调节物质、相对电导率和植物抗性相关酶指标进行测定分析，以期为枣引种栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年1月在塔里木大学园艺站枣资源圃，选取骏枣、灰枣、赞晶、冬枣、大白铃、伏脆蜜、蜂蜜罐和永城长红8个品种休眠期的1年生枝条为材料。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理方法

将供试枝条剪留长度为10～15 cm枝段，先用自来水和去离子水洗涤晾干，再用石蜡密封两段剪口，避免失水。按试验设计分为6组，每组25条用塑料袋分装好待处理，每处理设3个重复。包于报纸中并做好标记，置于高低温实验箱（BPH−060型，中国）中，降温速度为4℃/h，待温度降到设定温度后，冷冻12 h，然后以4℃/h的速度升温，达到4℃后，转入普通冰箱4℃保存12 h。试验共设−10℃、−15℃、−20℃、−25℃、−30℃共5个低温处理并以4℃处理作为对照。

1.2.2 抗寒性指标的测定方法

电解质的相对外渗率测定：用电导仪（DDS−307型，中国）测定其电导值即处理电导率值，以相对电解质渗透率表示细胞膜通透性的大小［5］。

渗透调节物质含量的测定：丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法［6］，可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝比色法［7］，可溶性糖、淀粉含量的测定采用蒽酮比色法［5］，脯氨酸含量的测定采用茚三酮法［6］。

保护酶活性的测定：超氧化物歧化酶采用氮蓝四唑NBT光化还原法，过氧化物酶采用愈创木酚法［7］。过氧化氢酶（Catalase,CAT）高锰酸钾滴定法。

1.3 数据统计与分析

数据统计及图表制作用Microsoft Excel，结果分析用DPS分析。

2 结果与分析

2.1 低温处理对枣枝条电解质外渗率的影响与半致死温度计算

2.1.1 低温处理对枣枝条电解质外渗率的影响

植物在受到冻害后，部分细胞破裂导致电解质渗出，可以间接表现出受损细胞占比［8］。由图1可知，随着温度的降低，各品种的相对电导率逐步增加。在8个品种中永城长红处于较低的水平。而骏枣、冬枣电导率值总体处于较高的水平。随着温度降低相对电导率从−10℃到−30℃，大白铃、蜂蜜罐、赞晶、冬枣、灰枣、伏脆蜜、骏枣和永城长红的相对电导率分别增加2.48、2.44、2.32、2.31、1.95、1.92、1.91和1.87倍。各品种相对电导率都相对增加了2倍左右，其中增加最多的是大白铃，增加最少的是永城长红。

图1 不同低温处理枣枝条相对电导率的变化

2.2 低温处理对枣枝条渗透调节物质含量的影响

2.2.1 低温处理对枣丙二醛含量的影响

丙二醛是衡量氧化胁迫程度的重要指标，能反映植物质膜过氧化的程度。由图2可知，随温度的降低8个供试材料丙二醛含量均增加，除伏脆蜜、赞晶与永城长红趋势为一直上升，其它品种均呈先上升后下降趋势。大白铃在−20℃时MDA含量达到其低温的最高值7.04µmol/g，赞晶、伏脆蜜和永城长红均在−25℃达到极值。在8个品种中灰枣在各温度处理下MDA含量均高于其他品种，最高达到10.25µmol/g，伏脆蜜是所有品种中MDA含量最低的，各温度下MDA含量均值仅为5.21µmol/g。

图2 不同温度处理枣枝条MDA含量的变化

2.2.2 低温处理对枣可溶性糖和淀粉含量的影响

在植物受到冷害、冻害时，植物细胞内大分子物质可通过水解转化为糖，糖可通过提高渗透浓度保护细胞［9］。由图3可知，不同枣品种枝条糖含量随着温度的降低有升高的趋势。赞晶、大白铃和伏脆蜜3个品种枝条糖含量在−20℃有一个高峰，峰值出现早、含量低，灰枣枝条糖含量变化较平稳，高峰出现较晚浓度低。在整个低温胁迫的过程中骏枣、冬枣枝条糖含量相对平稳，−30℃低温胁迫下枝条糖含量最高，分别是−15℃时即最低值的1.54、1.6倍，而在−30℃低温胁迫的蜂蜜罐、永城长红枝条糖含量较−15℃下提高了4.17倍、4.62倍。

图3 不同温度处理枣枝条可溶性糖含量的变化

由图4知，淀粉含量和可溶性糖变化相似，总体上是增加的，大部分品种在−15℃淀粉含量高而−20℃含量低，与可溶性糖相反，从−15℃开始大量的淀粉开始转化为可溶性糖，淀粉含量的变化没有可溶性糖含量变化大。在−10℃时冬枣、赞晶和灰枣的含量较低，随着温度降低，冬枣、赞晶和灰枣的淀粉含量低于其他品种。蜂蜜罐、伏脆蜜和骏枣的淀粉含量从−15℃开始稳定增加而其他品种淀粉含量是从−20℃开始稳定增加。其中冬枣淀粉含量增加的幅度较小，而赞晶淀粉含量增加的幅度较大。

图4 不同温度处理枣枝条淀粉含量的变化

2.2.3 低温处理对枣枝条游离脯氨酸含量的影响

低温逆境下游离脯氨酸是很重要的渗透调节物质。如图5，随着温度不断降低枣枝条游离脯氨酸的含量先增加后减少，8个品种都是在−25℃达到峰值，在峰值含量中冬枣的游离脯氨酸含量最高为0.51µg/g，灰枣、伏脆蜜、永城长红、赞晶、蜂蜜罐和大白铃6个品种游离脯氨酸的含量相近范围在0.44µg/g～0.39µg/g之间，而骏枣的游离脯氨酸的含量是最低的，为0.32µg/g。在整个过程中灰枣和永城长红2个品种游离脯氨酸含量变化增值最大，在−15℃低温胁迫下灰枣和永城长红枣枝条游离脯氨酸的含量为0.03µg/g和0.05µg/g，随着温度降低在−25℃，游离脯氨酸的含量变化为0.44µg/g和0.51µg/g，分别增加了13.2倍和11.4倍。

图5 不同温度处理枣枝条脯氨酸含量的变化

2.2.4 低温处理对枣枝条可溶性蛋白含量的影响

可溶性蛋白作为渗透调节物质、能量物质和信息传递物质，在植物抵御逆境的过程中起到较大的作用［10］。有研究表明，遭受低温胁迫的植物，体内可溶性蛋白含量会增加，且细胞内可溶性蛋白和抗寒冻性之间表现出明显的相关性［8］。由图6可知，随着温度的降低不同枣品种枝条蛋白质含量呈先增加后减少的趋势。永城长红和蜂蜜罐的蛋白质含量在−20℃达到最高峰，分别为7 721.63µg/g和6 799.18µg/g。而冬枣在−30℃还有上升的趋势即还没有达到峰值。其他品种均在−25℃达到峰值，所以冬枣有较好的抗寒性而永城长红、蜂蜜罐两个品种峰值出现的较早，灰枣、伏脆蜜和大白铃在低温胁迫下变化较平稳，但灰枣的蛋白质浓度一直处在一个较高的水平。

图6 不同低温处理枣枝条可溶性蛋白质含量的变化

2.3 低温处理对枣枝条保护酶活性的影响

2.3.1 低温处理对枣枝条POD活性的影响

POD酶是植物所产生的一类氧化还原酶，它们能催化多种反应。过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。由图7可知，POD酶活性随着温度的降低活性逐渐升高，大部分品种在−20℃～−25℃度之间变化明显，−25℃之后都趋于平缓。永城长红枝条POD活性在低于−20℃的变化趋势趋于平稳。蜂蜜罐枝条POD活性在低温处理的过程中峰值相对高于其它品种高达436.38 U/g·min，呈现先增加后降低的趋势。

图7 不同温度处理枣枝条POD酶活性的变化

2.3.2 低温处理对枣枝条SOD活性的影响

SOD是一种源于生命体的活性物质，且是一种含有金属元素的活性蛋白酶，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。由图8可知随着处理温度的不断降低，各品种枝条中的SOD活性呈先升高后降低的趋势。在−20℃达到峰值，−20℃～−25℃之间下降缓慢，−25℃之后SOD活性迅速下降。冬枣枝条SOD活性在−20℃所达到的峰值（498.04 U/g·min），是所有品种中SOD活性最高的。

图8 不同温度处理枣枝条SOD酶活性的变化

2.3.3 低温处理对枣枝条CAT活性的影响

CAT是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，使得H2O2不至于与O2在铁螯合物作用下反应生成−OH，存在于细胞的过氧化物体内。CAT的变化趋势与SOD的相同，都是先增加后减少，在−15℃～−20℃时CAT酶活性上升较快，8个品种CAT酶活性平均上升2.21倍，变化最大的是灰枣枝条，在−20℃时CAT活性较−15℃时增加了4.19倍。在整个低温处理的过程中永城长红枝条的CAT活性高于其他品种，CAT活性在−25℃时达到极值362.32 U/g·min。

图9 不同温度处理枣枝条CAT酶活性的变化

2.4 抗寒性指标相关性

由表1可以看出温度与电导率、POD酶活性呈极显著性负相关（−0.98**，−0.97**），与淀粉、蛋白质呈显著性负相关（−0.90*，−0.89*），说明在整个低温处理的过程中相对电导率、POD酶活性、淀粉、蛋白含量有上升的趋势。电导率与淀粉、蛋白质呈显著性正相关（0.89*，0.88*）。电导率增加的过程中枝条中的淀粉、蛋白质含量也呈逐渐上升的趋势。脯氨酸与蛋白质、MDA含量、CAT酶活性呈极显著性正相关（0.95**，0.97**，0.92**），即脯氨酸含量越来越高时，蛋白质、MDA含量、CAT酶活性也随之提高。POD酶活性与蛋白质、电导率呈极显著性正相关，与脯氨酸、MDA含量呈显著性正相关（0.97**，0.96**，0.85*，0.89*）。蛋白质与 MDA 呈极显著正相关（0.97**），蛋白质含量越高MDA含量越高。CAT酶活性与MDA含量呈显著性正相关（0.90*），说明MDA含量越来越高时CAT酶活性越来越高。

表1 枣枝条抗寒性指标相关性分析

2.5 人工低温胁迫过程中不同枣品种灰色关联度抗寒性评价

灰色关联多维综合评判分析克服了靠单一变量评价品种优劣的弊端，评价客观全面，更能真实地反映品种的实际表现，提供更可靠的依据［11］。通过对数据的无量纲化处理、差序列处理最后得到各品种各抗寒性指标的关联系数，如表2所示。通过对10个指标的灰色关联多维综合评判分析所得到的关联度分析结果为赞晶＞大白铃＞冬枣＞灰枣＞永城长红＞骏枣＞伏脆蜜＞蜂蜜罐。

表2 不同枣品种灰色关联度抗寒性综合评价

3 讨论

在评价果树抗寒性的研究过程中，电解质渗透率测定作为一种植物抗寒性鉴定方法，目前已广泛应用于果树抗寒的测定［12−16］。本研究证明随着温度的降低，各品种的相对电导率逐步增加，温度下降枣枝条的电解质外渗率提高，温度越低，枝条受到的伤害越大。在−20℃～−25℃温度区间相对电导率急剧上升，在此温度区间细胞破裂率最高。渗透调节是植物对逆境条件下的适应性的表现，植物通过自身的防御系统来控制代谢，通过渗透调节物质来适应逆境带来的伤害［17］。可溶性糖随着温度的降低总体呈增加的趋势，在−10℃～−20℃之间可溶性糖呈先减少后增加的趋势，而淀粉正好相反呈先增加后减少的趋势，在−20℃以后都有增加的趋势，不过淀粉的增加较平缓。段肖翠［12］、孟庆瑞［18］、姚方等［19］指出抗寒性较好的品种在初期淀粉含量下降较早而糖含量峰值出现较早，灰枣、赞晶、大白铃3个品种在低温刚开始就具有较高的糖含量，高糖含量会降低组织液冰点，从而提高植物抗寒性。低温胁迫会引起可溶性蛋白质含量的变化［20］。各品种在低温处理过程中蛋白含量呈先增加后降低的趋势，大多品种在−20℃～−25℃温度区间下到达峰值，蛋白的积累会增强树体抗寒保护物质的形成这与龙春跃等［13］对库尔勒香梨枝条、花芽冻害发生程度与相关生理指标研究所得出的结论一致。通过低温处理枣枝条保护酶活性均呈先增加后降低的过程。大部分品种POD酶活性在低于−25℃温度区间中表现较平稳，而永城长红与冬枣的POD酶活性还有上升的趋势。研究表明POD酶活性较高的品种对低温表现出更好的耐受力［21］。与POD酶不同，所有品种的SOD酶和CAT酶活性在低于−25℃后下降。大多数品种酶活性在−20℃～−25℃之间酶活性较高。

对不同枣品种不同温度梯度渗透调节物质、相对电导率和植物抗性相关酶指标进行测定发现−20℃～−25℃温度区间中，相对电导率急剧上升，糖、丙二醛、蛋白质和脯氨酸等渗透调节物质峰值出现在此区间中，SOD和POD酶也在该温度区间达到峰值。研究表明［22−24］，−25 ℃度为林木抗寒的关键温度，相关性分析中发现，温度与电导率、POD酶活性呈极显著性负相关（−0.98**，−0.97**），与淀粉、蛋白质呈显著性负相关（−0.90*，−0.89*），与苹果［25］、杏［10］、梨［26］、阿月浑子等［12］树种的抗寒性研究所得结论一致。

植物抗寒性进行评价中，不同生理指标有不同的生物学意义［27］。应用单一指标对植物的抗寒性进行评价并不能得到较准确的结果，本研究对渗透调节物质、相对电导率和植物抗性相关酶指标进行测定并应用灰色关联度进行综合评价［28−29］。

4 结论

随着温度的降低，8个枣品种的相对电导率逐步增加，可溶性糖和淀粉随着温度的降低总体趋势呈增加的趋势，糖含量的变化与淀粉含量变化趋势相反，通过低温处理枣枝条蛋白、脯氨酸和保护酶活性均呈先增加后降低的趋势。

在−20℃～−25℃温度区间中，相对电导率急剧上升，可溶性糖、丙二醛、蛋白质和脯氨酸等渗透调节物质峰值出现在此区间中，SOD和POD酶活性也在该温度区间达到峰值，枣枝条生理指标响应关键温度区间为−20℃～−25℃。温度与电导率、POD酶活性呈极显著性负相关，与淀粉、蛋白质呈显著性负相关。

应用灰色关联度法对8个枣品种的抗寒性进行综合评价，抗寒性顺序为赞晶＞大白铃＞冬枣＞灰枣＞永城长红＞骏枣＞伏脆蜜＞蜂蜜罐，赞晶是最抗寒品种，蜂蜜罐抗寒性较低。