鸽圆环病毒新疆株全基因组克隆与序列分析

米晓云，吴建勇，马文戈，日孜瓦古·努尔东，王琦，盛肖刚，黄炯，魏玉荣*

（1新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐，830013）

（2巴音郭楞职业技术学院，新疆 库尔勒，841000）

（3新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆 乌鲁木齐，830013）

鸽圆环病毒（Pigeon circovirus，PiCV，又称Colum⁃bid circovirus，CoCV）是已知最小的致病性病毒，呈二十面体对称球形，无囊膜，直径为17～22 nm，基因组由大约1.7～2.3 kb的单链环状DNA组成［1−2］。PiCV于1993年在美国被首次报道，此后许多国家和地区陆续发现该病［3−4］。余旭平等［5］于2009年在浙江地区鸽群中检测并报道了国内首例PiCV。随后，福建、江苏、上海、山东、河北、安徽、广东等地均有PiCV病例报道［6］。PiCV的全基因组于2000年首次被克隆［7］。国内全基因组克隆并序列分析的毒株有ZJ1株、ZJ2株、FJ1株及JS15−1株［5,8−9］。虽然不同毒株之间有着微小的长度变化，但是基因组均含5个开放阅读框（ORF），分别是V1、C1、C2、以及3'基因间区和5'基因间区［10−11］。ORF V1 以 ATG 为起始密码子编码含315～318个氨基酸的复制相关蛋白（Rep）。ORF C1以ATG/ATA为起始密码子编码含270～274个氨基酸的病毒外壳蛋白（Cap）［11］。其他ORF的功能目前未知。

本文根据已发表的PiCV全基因组序列设计引物，对采集于和田地区墨玉县种鸽场已检测呈PiCV阳性的病料进行全基因组序列克隆和测序，并进行序列分析，为疫苗候选开发提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新疆和田地区墨玉县规模化种鸽场3—4月龄病鸽样本（心、肝、肺、大肠及喉管），采集后−20℃保存备用。

1.2 试剂

TIANamp Virus DNA/RNA Kit、2xPCR MasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司；5 000 bp DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；Wizard®SV Gel and PCR Clean−Up System、Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；pEASY−T1载体、Trans1−T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中已发表的PiCV基因组序列（GenBank登录号：KX108805），设计引物，见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于PiCV完整基因序列扩增。

表1 引物序列

1.4 病毒DNA提取

前期检测并测序鉴定其携带PiCV的病鸽肝脏组织取10 g于研钵中剪碎备用［12］。将剪碎的病料组织置于无菌研钵中，按1:5比例加入无菌PBS（pH 7.4），并加入少许石英砂研磨匀浆，匀浆混合液收集于50 mL离心管中，反复冻融3次，取上清液，12 000 rpm离心5 min，再次取上清液，按TIANamp Virus DNA/RNA Kit试剂盒说明书提取病毒DNA。

1.5 基因组克隆与测序

将提取的DNA样品作为模板扩增PiCV的全基因，PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增体系（总体积为25µL）：模板2µL，2×PCR MasterMix 12.5µL，PiCV−1−U/D上下引物各0.5µL，RNase Freed ddH2O 9.5µL。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，59℃退火40 s，72℃延伸100 s，共30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。将特异性PCR产物胶回收纯化后与pEASY−T1载体连接，转化至Trans1−T1感受态细胞，筛选、初步鉴定阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6 基因组结构分析

测序结果经BLASTn比对分析确认。测序序列用DNAStar软件进行整理、校对并拼接及核苷酸同源性比较。对获得的序列用Vector NTI进行ORF查找及相关特征性序列分析。用MEGA5.0软件采用Neighbor−Joining法，p−distance模式，以鹅圆环病毒株（GenBank登录号：GU320569）GoCV作为外支，用步展值（Bootstrap）重复1 000次对进化树的可靠性进行评估。

2 结果与分析

2.1 全基因组扩增结果

将前期鉴定携带PiCV的鸽肝样本DNA作为模板，进行PiCV的全基因组PCR扩增，电泳结果显示扩增样品约2 031 bp的特异性片段，与预期大小相符（见图1）。目的条带切胶回收，连接pEASY−T1载体用于基因测序。

图1 XJ1株基因组扩增结果

2.2 新疆株PiCV基因组结构分析

测序序列拼接得到完整的PiCV基因序列（Gen⁃Bank登录号：MT614188）。完整序列比对分析表明，XJ1株基因组全长为2 031 bp，编码5个ORF，分别为ORF V1（41～994 nt）、ORF C1（1 166～1 981 nt）、ORF C2（410～790 nt）、ORF C3（2～292 nt）和 ORF C4（739～984 nt）（图2）。其中ORF V1编码含317个氨基酸的复制相关蛋白Rep，ORF C1编码含271个氨基酸的衣壳蛋白Cap，其余3个ORF编码功能未知。与文献报道一致，XJ1具有PiCV的共有特征：ORF V1和ORF C1起始之间有一茎环结构，茎环上有9碱基保守序列TAGTATTAC；茎环附近有反向重复序列CACG⁃GAGCCAYATCGC，此序列可能是PiCV复制酶的结合位点［7］。茎环附近还有4个正向重复序列GGAGCC；Rep蛋白中包括3个与滚环复制相关的保守基序（FTLNNP、TPHLQG、YCSK）及其他保守基序（WWDGY、DDFYGWLP、DRYP）［13］。

图2 XJ1株环形基因组的线性图谱

2.3 全基因组的同源性分析

用DNAStar软件中的MegAlign对自测的XJ1株与GenBank中，国内外其他24株PiCV毒株的全基因序列进行比对（参考毒株见表2）。结果显示XJ1株与其他24株全基因组核苷酸同源性在87.3%～94.9%之间，与GF17（KX108806）的同源性最高达94.9%；而其他毒株之间核苷酸同源性在85.2%～97.8%之间（表3）。

表2 PiCV毒株概况

表3 PiCV XJ1株与其他毒株基因组核苷酸同源性比较

2.4 全基因组进化树分析

以GoCV作为外支，用MEGA5.0软件Neighbor−Joining法，p−distance模式，Bootstrap检验1 000次重复，对25株PiCV全基因组构建遗传进化树，分析不同来源鸽圆环病毒的亲缘关系（见图3）。结果可见，25株PiCV在遗传进化上依据核衣壳蛋白Cap的起始密码子不同（见表2）而分为明显的2个分支，即分为ATA分支和ATG分支。基于Cap蛋白的遗传进化树显示XJ1与ATG分支中GF82（GF82/Guangdong/2014）、GF17（GF17/Guangdong/2014）及 GH1834（GH1834/GuangDong/2014）亲缘关系最近。

图3 基于Cap蛋白的鸽圆环病毒基因遗传进化分析

3 讨论

PiCV是一种免疫抑制病原，主要感染青年赛鸽及肉鸽，以4月龄以下的鸽子最为易感染，因此又称为“青年鸽病综合征”（young pigeon disease syndrome，YPDS）。PiCV既可通过污染的粪便、饲料及饮水等方式水平传播，又可经鸽胚胎垂直传播［14,15］。2014年，ZHANG Z等［16］对华东地区六个鸽场进行流行病学调查，结果显示PiCV在病鸽群和外观健康鸽群阳性率分别是80.7%（88/109）和63.3%（31/49）。2017年，HUANG Y等［17］对淘汰赛鸽中164羽死亡鸽子进行PiCV检测，结果阳性率为96.95%（159/164）。本实验室调查发现新疆和田地区墨玉县种鸽场鸽群存在一定比例PiCV感染，阳性率为47.29%（96/203）［12］。

PiCV感染会造成鸽免疫系统损伤，继而增加感染其他病原体的潜在风险。MANKERTZ A等［7］根据PiCV基因组序列特征，首次将PiCV归入圆环病毒科的圆环病毒属。鸽圆环病毒基因序列特性的深入研究，有助于病毒致病机理探索、诊断方法建立及防控产品的开发［18,19］。

本研究测序株XJ1基因组全长为2 031 bp，全基因组序列核苷酸相似性比较结果显示XJ1与GF17（GF17/Guangdong/2014）和 GH1834（GH1834/Guang⁃dong/2014）的同源性最高（均为94.9%），与Ita 4B株同源性最低，仅为87.3%。XJ1全基因组编码ORF V1、ORF C1、ORF C2、ORF C3和ORF C4等5个编码框，在编码框外还存在与其复制、增殖相关的5'端基因间隔区和3'端基因间隔区。5'端基因间隔区位于ORF C1和ORF V1之间，有一茎环结构，茎环上有9碱基保守序列TAGTATTAC；茎环附近有反向重复序列（CACGGAGCCATATCGC和GCGATATGGCTCC⁃GTG及2个GGAGCC和GGCTCC）；XJ1株5'端基因间隔区长度为90 nt，与其他参考毒株略有差异。3'端基因间隔区位于ORF C1和ORF V1之间（995～1 165 nt），长度为 171 nt。与文献报道一致，XJ1 株Rep蛋白中也包括3个与滚环复制相关的保守基序（FTLNNP、TPHLQG、YCSK）及其他保守基序（WWDGY、DDFYGWLP、DRYP）［13］。

ORF C1编码的Cap蛋白有ATG和ATA两类起始密码子（表2）。万春和等［8］认为起始密码子的不同与3'端基因隔区长度相关，当3'端基因间隔区长度为171 nt时，Cap蛋白的起始密码子为“ATG”，而长度是170 nt时，Cap蛋白的起始密码子为“ATA”。然而，TODD D等［11］在鸽圆环病毒序列组成研究中列表比较分析了12个序列的Cap蛋白起始密码子，研究结果正好与万春和等人相反，即当3'端基因间隔区长度为171 nt时，起始密码子为“ATA”，而长度是170 nt时，起始密码子为“ATG”。但是，仔细对比万春和及TODD等学者文章中列举的毒株序列位点，结合本研究中下载自GenBank中序列及XJ1基因序列分析，结果显示这两种起始密码子在Cap蛋白中呈随机分布，与3'端基因隔区长度相关性不大。XJ1株与国内外发表的24株鸽圆环病毒序列全基因作基于Cap蛋白的遗传进化分析，PiCV在遗传进化中具有明显的ATA分支和ATG分支，与Cap蛋白起始密码子相一致（表2）。国内毒株虽处于不同亚群但均处于ATG分支，且大部分毒株（14/17）3'端基因间隔区长度为171 nt，仅浙江株（ZJ1和ZJ2）及JS15−1株（3/17）的3'端基因间隔区长度为170 nt。XJ1株与ATG分支中的广东毒株 GF82（GF82/Guangdong/2014）、GF17（GF17/Guangdong/2014）及 GH1834（GH1834/Guang⁃dong/2014）可能来源相同。

基于流行病学结果，PiCV感染及继发感染已经给国内养鸽业造成严重损失。但迄今为止，PiCV还无法体外细胞培养，极大限制了PiCV各方面的深入研究。本研究对新疆PiCV基因序列特性的深入研究，有助于通过基因工程手段开发疫苗产品用于该病的防控。

4 结论

XJ1株基因组全长为2 031 bp，有5个阅读框；基因间隔区长度分别为90 nt和171 nt。XJ1全基因组序列与国内GF17和GH1834的同源性最高（均为94.9%）。基于Cap基因遗传进化树显示，XJ1株与Cap蛋白起始密码子“ATG”分支中GF82、GF17及GH1834亲缘关系最近。这是新疆首次测定PiCV全基因组序列，有助于PiCV疫苗开发。