复方葶苈子汤对低氧性肺动脉高压大鼠mPAP、肺血管重构的干预作用

刘爱平 刘俊 谢蕾 柏正平

摘要：目的观察探讨复方葶苈子汤对低氧性肺动脉高压（HPH）大鼠平均肺动脉压力（mPAP）的影响，针对HPH的发病机制，探索有效防治方法，为临床应用提供一定的试验依据。方法将健康雄性SD大鼠50只，分为正常组、HPH模型组、强的松组、复方葶苈子汤中、高剂量组，各组10只，分别于每日给药后放入低氧舱8 h，连续干预21 d后根据改良右心导管术测大鼠平均肺动脉压力并记录，同時光镜下观察大鼠肺动脉HE染色及弹力纤维染色并记录。结果实验测得结果提示HPH模型组mPAP明显高于正常组，且高于其他3组。复方葶苈子汤中、高剂量组大鼠mPAP较西药强的松组大鼠有所降低，差异具有统计学意义（P<0.05）与HPH模型组相比，复方葶苈子汤组大鼠肺血管管壁较薄，管腔变宽;与复方葶苈子汤组相比，强的松组大鼠肺动脉管壁增厚，管腔变窄。结论“饮瘀同治”的复方葶苈子汤可抑制甚或部分逆转低氧性肺动脉高压大鼠的肺血管重构，从而降低低氧性肺动脉高压大鼠的肺动脉压力。

关键词：复方葶苈子汤;低氧性肺动脉高压;肺胀

中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2021）02-0067-04

低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH）是多种肺系疾病长期反复发作，引起肺血管阻力及肺动脉压力升高，据统计，HPH普通人群患病率约为1%，而65岁以上人群的患病率高达10%[1]，HPH患病率至少为15/100万[2]，目前针对HPH的治疗药物不能预防或逆转疾病的进展[3]，因此探索新的治疗方法显得十分必要。

中医古籍中无低氧性肺动脉高压的记载，临床上我们根据其临床表现将其归于“肺胀”范畴，肺胀的病机多属“本虚标实、饮瘀互结”[4]。本虚主要为“阳虚”、“气虚”，常贯穿于病程之中，标实主要为“痰浊”、“水饮”、“瘀血”，其在疾病过程中是不断变化发展的[5]。痰饮之为病，影响广泛，故有云“百病多因痰作祟”。又如《金匮要略》所述“血不利则为水”，《血证论》所述：“血积日久，亦化为痰水”。表明“痰浊”、“水饮、“瘀血”等病理因素相互影响，互为因果，痰瘀互结，胶着难解。复方葶苈子汤是由柏正平主任根据中医基础理论和临床多年实践而拟定的经验方，其临床应用多年取得了较好的疗效。本文实验观察大鼠平均肺动脉压（mean Pulmonary artery pressure，mPAP）、及观察大鼠肺动脉HE染色及弹力纤维染色出发，进一步探讨“饮瘀同治”的复方葶苈子汤治疗HPH的可能机制，为复方葶苈子汤临床治疗提供理论基础。

1材料与方法

1.1实验动物及实验条件健康清洁级雄性SD大鼠50只，鼠龄6～8周，体重约（230±20）g，湖南省中医药研究院动物实验中心提供，合格证号：N0.43004700042712。动物房清洁消毒，控制室温在20℃～25℃，相对湿度65%～75%，自由进食饮水，分笼饲养，动物饮水及饲料每日检查添加。

1.2实验药品（1）强的松片 规格：5 mg×100片，批准文号：国药准字H31020771，上海上药信谊药厂有限公司。（2）复方葶苈子汤的制备：葶苈子10 g，水蛭3 g，黄芩10 g，矮地茶15 g，桂枝10 g，茯苓10 g，白术10 g，干地龙10 g，甘草5 g，中药先浸泡30 min，后煎熬45 min，过滤去渣，药液浓缩至166 mL，即每mL含2 g生药。放入冰箱保存备用。中药药材购自湖南省中医药研究院附属医院。

1.3主要实验试剂苏木素染色液（广州市秀威贸易有限公司，BC-DL-066-50mL）;间苯二酚染液套装（武汉谷歌生物科技有限公司，G1054）。

1.4主要实验仪器测氧仪（上海嘉华公司，CY-12CB）;低氧舱（自制）;MP100多导电生理仪（美国BIOPAC公司，BioNomadix）;正置光学显微镜（日本Nikon公司，Eclipse Ci-E/L/S）;成像系统（日本Nikon公司，DS-U3）;显微镜（常州恒隆仪器有限公司，OPTEC CCD TP510 200×）;电子天平（上海精密科学仪器 JA1003N）;实验室PH计（瑞士METTLER TOLEDO，S20），酶标仪（德朗Diatek公司，DR-200Bs）。

1.5实验方法

1.5.1实验动物分组健康清洁级雄性SD大鼠，采用随机数字表法分组，分为正常组、HPH模型组、强的松组、复方葶苈子汤中、高剂量组，各组10只，大鼠自由进食饮水。

1.5.2给药（1）正常组：大鼠于正常环境中活动及进食，每日生理盐水（1mL/100g）灌胃，饲养21 d。（2）HPH模型组：大鼠根据彭公永等[6-7]方法进行造模，将大鼠置于常压低氧舱内，设置并调控舱内氧浓度，向舱内输入氮气，调控舱内氧浓度为（10±0.5）%，每日缺氧8 h，低氧干预持续21 d。每日予生理盐水（1 mL/100 g）灌胃30 min后放入低氧舱。（3）强的松组：本实验选用强的松片作为西药对照组，每日放入低氧舱前30 min灌胃;强的松片，5 mg/片，人最高用量为60 mg/d，大鼠用药剂量按体表面积折算相当于人临床用药等效剂量为7.8 mg/d，实验时使用2倍等效剂量15.6 mg/kg，用3mL蒸馏水配制[8]。其余同HPH模型组。（4）复方葶苈子汤中剂量组：根据大鼠表面积换算选定10 g/kg·d药液为中剂量组，每日放入低氧舱前30 min灌胃。余同HPH模型组。（5）复方葶苈子汤高剂量组：根据大鼠表面积换算选定20 g/kg.d药液为高剂量组，每日放入低氧舱前30 min灌胃。余同HPH模型组。

1.5.3一般情况观察及肺动脉压力测定（1）观察一般情况：造模期间，每日对大鼠的精神状态、活动状况、呼吸、口鼻分泌物、进食等情况进行观察并及时记录，期间对死亡大鼠作相应处理和记录。（2）肺动脉压力测定：大鼠末次给药后根据孙波[9]及黄晓颖等[10]插入导管法测定mPAP。首先大鼠称重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（2～4 L/kg），肝素（50u/mL）抗凝，仰卧位固定，剪除颈部鼠毛并消毒，暴露分离右侧颈外静脉，以医用眼科剪于静脉中上1/3处斜行剪开颈外静脉，作“V”形切口，以镊子稍提起近心端切口边缘，插入测压导管。导管插入时保持导管弧向上。经右心房及右心室送到肺动脉，待肺动脉压力波形稳定后用生理记录仪记录mPAP。

1.5.4实验动物处理、取材及标本制备

1.5.4.1苏木素-依红（hematoxylin-eosin，HE）染色测压结束后处死大鼠，剖取肺脏。以生理盐水漂洗肺组织，剪下右肺，取肺动脉行HE染色;待光镜下观察。

1.5.4.2弹力纤维染色（1）肺动脉石蜡切片，常规脱蜡至水。（2）酸化高锰酸钾（高锰酸钾：硫酸=1∶1混合）氧化5 min，水洗后，用草酸溶液漂白1～2min。（3）流水冲洗2min。（4）切片放入装有间苯二酚品红染色液中加盖浸染染色，室温下3～4 h，流水冲洗。（5）盐酸酒精分化至无染液脱下，弹力纤维清晰的紫红色，背景近乎无色。（6）将饱和苦味酸与酸性品红9∶1混合成VG染液，切片水甩干，染3 min，快速水洗，正丁醇透明。（7）透明，封片处理;（8）显微镜图像采集分析。

1.6统计学方法各分组所得计量数据采用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS22.0统计软件处理数据，各组间比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析。P<0.05表示有统计学意义。

2结果

2.1大鼠一般情况（1）正常组大鼠精神好，毛发光泽、活动度高，进食正常，反应敏捷，实验期间未出现死亡。（2）HPH模型组、强的松组、复方葶苈子汤中、高剂量组大鼠在低氧环境中出现不同程度的精神欠佳，毛发杂乱，呼吸急促，口鼻分泌物增加，昏昏欲睡，少动少食。其中HPH模型组大鼠死亡3只;强的松组大鼠死亡3只;复方葶苈子汤中剂量组大鼠死亡3只、复方葶苈子汤高剂量组大鼠死亡2只;大鼠死亡原因考虑如下：①灌胃操作存在失误，导致误入肺组织而死。②低氧状态下肺部炎症及呼吸困难而致死亡。③个别大鼠体质弱，对实验药物不耐受。④踩踏。⑤其他。

2.2大鼠mPAP的变化造模结束后测得大鼠mPAP的情况，（1）与正常组大鼠mPAP相比，HPH模型组、强的松组、复方葶苈子汤中、高剂量组大鼠mPAP均增高，差别具有统计学意义（P<0.05）;结合造模组大鼠的一般情况，可表明低氧性肺动脉高压大鼠的造模是成功的。（2）与HPH模型组相比，其余4组大鼠mPAP均降低，差别具有统计学意义（P<0.05）;其中强的松组大鼠mPAP较复方葶苈子汤中、高剂量组增高，差异具有统计学意义（P<0.05），中剂量组大鼠mPAP较复方葶苈子汤高剂量组增高，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。（见表1）

2.3大鼠肺血管组织学改变光镜下观察大鼠肺动脉HE染色及弹力纤维染色发现，正常组大鼠肺小动脉管壁薄且均匀，管腔大且通畅，内皮细胞连续性较好;HPH模型组大鼠肺小动脉管壁明显增厚，管腔狭窄明显，内皮细胞的连续性破坏，管腔内见弹力纤维增生及受损，血管结构变化较明显（见图1B及图2）。与HPH模型组相比，强的松组大鼠肺小动脉管壁稍薄，管腔略有增宽;复方葶苈子汤中、高剂量组大鼠的肺小动脉管壁薄，管腔增宽。结合弹力纤维染色，复方葶苈子汤高剂量组大鼠肺小动脉形态几乎恢复至正常组的状态，我们可认为肺小动脉重构得到抑制甚或部分逆转。（见图1、图2）

3讨论

现阶段研究认为，低氧性肺动脉高压的发病机制主要因缺氧而致肺血管异常收缩、肺血管阻力增加引起肺小动脉痉挛、收缩，肺阻力增加，肺血管重构，进而导致肺血流动力学的改变。中医古籍中无低氧性肺动脉高压的记载，临床上根据其临床表现将其归于“肺胀”范畴，肺胀的病机多属“本虚标实、饮瘀互结”。本虚主要为“阳虚”、“气虚”，常贯穿于病程之中，标实主要为“痰浊”、“水饮”、“瘀血”，其在疾病过程中是不断变化发展的。痰饮之为病，影响广泛，故有云“百病多因痰作祟”。又如《金匮要略》所述“血不利则为水”，《血证论》所述“血积日久，亦化为痰水”。表明“痰浊”、“水饮、“瘀血”等病理因素相互影响，互为因果，痰瘀互结，胶着难解。而阳虚又可致水泛，导致水饮凌心，从而出现一系列症状。

复方葶苈子汤是由恩师柏正平根据以上中医基础理论和临床多年实践而拟定的经验方，由葶苈子、水蛭、黄芩、矮地茶、桂枝、茯苓、白术、干地龙、甘草组成。该方中葶苈子泻肺逐水、止咳平喘，为君;其可宣通肺部壅滞，加强肺气的宣发肃降之能，使水湿得以布散周身并下输于肾及膀胱，达到泻肺逐水之效;水蛭活血逐瘀，為臣，助其药效直达病所，并助葶苈子宣肺行气;黄芩清肺化痰、止咳平喘;茯苓、白术、桂枝共奏温脾化饮之效，脾阳得温，脾气得升，则痰饮得化，故绝其“生痰之源”。矮地茶长于化痰止咳，兼能平喘、利湿、活血化瘀;血液得行，瘀血得通，血利则水消气顺，故诸症自除。地龙具有通络平喘，利尿之效;甘草健胃和中，调和诸药;方中诸药使“痰饮”、“瘀血”等病理产物无所遁形，分利而出。中医学认为肺动脉压力增高是痰、饮、瘀相互作用的结果。故我们采取“饮瘀同治”之法，饮去则痰无生化之源，瘀行则肺络通畅，共奏泻肺逐饮、祛瘀通络、温阳化气之效。

实验观察到大鼠低氧1周后，造模组大鼠开始出现不同程度的精神欠佳，毛发杂乱，呼吸稍促，口鼻分泌物增加，少动少食，其中以HPH模型组更为明显，表明在常压低氧的情况下大鼠的一般情况及进食受到影响。与此同时复方葶苈子汤组大鼠精神稍好，活动较多，进食较HPH模型组大鼠增加。表明“饮瘀同治”的复方葶苈子汤能改善其症状。

感染、缺氧等因素导致肺血管收缩，肺阻力增加，肺血管重构，进而导致肺血流动力学的改变。实验测得结果提示HPH模型组mPAP明显高于正常组，且高于其他三组。复方葶苈子汤中、高剂量组大鼠mPAP较西药强的松组大鼠有所降低，说明复方葶苈子汤组与强的松组比较，其降低肺动脉压力的疗效较好，其中复方葶苈子汤高剂量组大鼠mPAP低于复方葶苈子汤中剂量组。表明复方葶苈子汤预防或治疗本病需达一定剂量。复方葶苈子汤复方汤剂的成分较为复杂，药味不单一，结合本方药物组成及中药现代药理研究，“饮瘀同治”的复方葶苈子汤可能是通过多方面、多靶点减轻肺小动脉收缩、痉挛，扩张肺血管，改善肺血管阻力，增加肺血管顺应性而降低肺动脉压力。

低氧性肺动脉高压的肺血管重构是以血管壁增厚为主要结构的改变，尤以中膜平滑肌增厚为主。我们从HE染色及弹力纤维染色观察到正常组大鼠肺血管管壁薄，管腔大，内皮细胞连续性较好;而HPH模型组大鼠肺血管管壁明显增厚，管腔明显变窄甚或闭塞，内皮细胞的连续性被破坏，弹力纤维受损或增生，肺血管结构改变。与HPH模型组相比，中药组大鼠肺血管管壁较薄，管腔变宽;与中药组相比，强的松组大鼠肺动脉管壁增厚，管腔变窄。表明“饮瘀同治”的复方葶苈子汤可抑制甚或部分逆转低氧性肺动脉高压大鼠的肺血管重构。

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（收稿日期：2020-09-09）