慢性应激模型中脾脏的相关研究概况

师铭咸，李 琳，范宏刚

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030)

随着社会的发展和工作节奏的不断加快，越来越多的人处于长期压力之下，由此导致的慢性应激相关疾病正逐渐引起科学家的广泛关注[1]。此外，在动物的转运和饲养中，也存在大量慢性应激现象，其中，运输应激和热应激比较常见。长途运输应激使得畜禽长时间处于应激状态，导致应激畜禽生长发育迟缓，免疫功能及生产性能下降，严重的可导致组织器官损伤，甚至个体死亡[2]；而长期高温环境下饲养，会使畜禽体温异常，引起热应激，表现为精神萎靡、食欲不振等[3]，严重影响养殖业经济效益。

本文简述了慢性应激和脾脏及其相互作用，慢性应激状态下动物脾脏的免疫机制研究，并讨论了目前研究面临的问题和不足，以及对未来研究方向进行了合理分析和展望，以期能对慢性应激模型中脾脏的相关研究提供理论支持。

1 慢性应激和脾脏及其相互作用

研究表明，应激能够显著影响机体免疫能力，影响人和动物的生活质量，以及诸多疾病的发展进程；脾脏是重要的免疫器官，能够调节机体对应激的抵抗能力。目前，两者的相互作用研究已逐渐成为比较医学和动物生产的热点研究问题。因此，本部分从慢性应激及相关实验模型、脾脏的组成和功能、慢性应激和脾脏的相互作用三部分，进行简要概述。

1.1 慢性应激及相关实验模型

应激(stress)指机体在各种内外环境因素及社会心理因素刺激下，产生的非特异性全身性反应，主要分为急性应激和慢性应激。其中，刺激持续时间较长，且引起机体反应持续时间也较长的应激类型称为慢性应激(Chronic stress)。慢性应激通过持续释放神经内分泌激素，引起机体病理性改变，涉及心血管疾病[1]、肥胖[4]、癌症[5]、免疫紊乱[6]，以及精神类疾病，如重度抑郁症、双相情感障碍和焦虑症等[7]。目前，慢性应激模型主要分为4类，即习得性无助慢性应激模型、行为绝望慢性应激模型、社交失败慢性应激模型以及慢性不可预知应激模型[8]。

习得性无助慢性应激模型，是将动物暴露在不可避免但又不可控的应激环境下，动物表现出无助、消极、类似抑郁的状态。近年来，科研人员通过将动物长时间置于单一应激源下,如足部电击[9]、寒冷环境[10]、束缚固定[11-12]、噪声[13]等，使动物出现无助的状态。应激动物常表现为体重减轻，性行为减少，促肾上腺皮质激素释放激素和皮质酮水平升高[14]。

行为绝望慢性应激动物模型，包括强迫游泳试验[15]和悬尾试验[16]。强迫游泳试验，是将实验动物置于一个局限的环境中，动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而提供了一个无可回避的压迫环境，一段时间后，动物表现出典型的绝望状态。悬尾试验，利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的不动状态，试验过程中记录动物不动时间来反映无助、绝望状态。

社交失败慢性应激模型，这种“居住者-闯入者”模式是啮齿动物特有的，它利用同一物种成员之间的社会冲突来产生心理情感压力，能够非常有效地模拟人类在社会活动中所表现的社交困难。将1只老鼠(称为闯入者)引入1只常驻雄性老鼠(称为居住者)的家庭笼子中，持续数天,记录居住者与闯入老鼠对抗的相关行为[17]，但是这种模型具有性别局限性，只发生在雄性大鼠中，因为雌性大鼠不会发生此类争斗。这种应激模型中的大鼠常表现为社会交往减少和快感缺乏[18]。

慢性不可预知应激模型，每天随机将啮齿动物置于不同的应激源下，包括足部电击、束缚、昼夜节律变化、噪声等，制造慢性不可预知应激模型[19]，这种造模方式能够更好地模拟人类长期处于复杂的生活环境中所表现出的压力现象，与人们实际生活中的压力状况更接近[20]。应激动物血浆皮质醇水平升高、糖水偏好降低[21]，运动能力及社会交往能力下降、探索行为能力下降、侵犯攻击能力缺陷、性行为能力下降[22]。

4类模型仅限于造模方式不同，造模成功的判定标准是一致的，应激动物通常表现为快感缺乏、对奖赏反应能力下降、体重减轻、摄食摄水减少、自主活动减少、兴趣减退等状态。行为学上，一般通过旷场试验和糖水偏好试验来判定造模是否成功[23]。同时，慢性应激造模成功的动物，HPA轴异常激活，生理指标上可见多巴胺、五羟色胺水平下降，皮质醇水平升高。其中，旷场试验，是评价实验动物在新奇环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法，以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等，反映实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为，以尿便次数反应其紧张度，慢性应激动物在旷场实验中，表现为运动能力减弱、探索行为减少、紧张度增加。糖水偏好试验，是通过测量一定时间内饮水瓶中水量的消耗，计算每只大鼠的糖水偏好百分比，用来评价动物快感缺失的程度，快感缺失是慢性应激动物模型造模成功的标志，慢性应激动物在糖水偏好试验中，常表现为糖水偏好百分比降低[24]。

1.2 脾脏的组成及功能

脾脏含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，其免疫细胞总数约占全身总量的25%，是机体行使细胞免疫和体液免疫的最大免疫器官。脾脏实质由边缘区、红髓和白髓组成。当血液中出现病菌和原虫等异物时，边缘区首先接触抗原并引起免疫应答，红髓中的吞噬细胞和淋巴细胞将异体抗原吞噬，白髓发挥特异性免疫应答功能[25]。脾脏还可以通过产生免疫球蛋白和补体等物质，增强免疫作用效果。

此外，脾脏还发挥机体重要的储血和输血功能，当机体安静时，血液回流脾脏，脾脏行使储血功能；当机体处于运动、失血、缺氧等应激状态时，血液流出脾脏，血容量增加，脾脏行使输血功能。同时，脾脏也可过滤血液中的异物、病菌及衰老死亡的细胞。

1.3 慢性应激与脾脏

研究表明，动物发生慢性应激后，免疫功能被抑制，机体抵抗力减弱，从而引发涉及炎症反应、氧化应激、细胞凋亡和脏器指数等病理性异常和动物行为学变化。

在慢性冷应激中，Balb/c小鼠脾脏内巨噬细胞表型发生变化，吞噬能力减弱，并刺激脾脏细胞产生调节细胞因子诱发免疫抑制，证实慢性冷应激通过调节巨噬细胞功能，使小鼠处于免疫抑制状态[10]。慢性应激除影响脾脏内巨噬细胞形态功能外，对其他免疫器官及其内免疫细胞同样具有显著作用。据报道，慢性应激大鼠胸腺、腋窝淋巴结重量减轻，胸腺、腋窝淋巴结内淋巴细胞计数和脾脏白髓岛数减少，脾脏细胞、胸腺细胞和淋巴细胞凋亡指数升高，且应激对淋巴器官的影响程度随暴露时间的延长而加重[26]。

在不同的慢性应激模型中，表现出相似的机体免疫抑制现象。长期噪音环境可引起人生理、心理和行为上的变化。为此，Zheng K C等[13]通过将Balb/c小鼠持续4周暴露于90分贝(dB)环境中，模拟慢性噪声应激，发现小鼠脾脏淋巴细胞计数降低，脾脏CD4+T细胞和血清IgG减少，说明慢性噪声应激可抑制机体细胞免疫和体液免疫。

在慢性冷应激中，鹌鹑脾脏内环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、前列腺素E合成酶(prostaglandin E synthase,PTGES)、核转录因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的基因表达量增加，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和一氧化氮(nitric oxide,NO)含量显著降低，丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量显著增加，表明慢性冷应激可引起鹌鹑脾脏组织炎症损伤和氧化应激[27]。

Van der Staay等[11]通过对比长期拴系和散养母猪体内相关激素水平和动物行为学结果，发现不同组间母猪脾脏重量无明显变化，拴系组血浆皮质醇水平升高，并表现出抑郁样症状，表明长期束缚应激可紊乱体内激素水平，并导致精神行为异常。

2 慢性应激模型中脾脏的免疫机制研究

当前，研究者主要通过在蛋白水平上筛选核心信号通路及靶点，以及在细胞水平上探究淋巴细胞及其亚群的生物学特性等角度，阐述慢性应激对动物脾脏的免疫学作用机制，这将为日后的精准作用、持续监测和治疗方案的制定，提供一定的理论和实践依据。

Hu D等[28]通过检测慢性束缚应激小鼠脾脏内白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)含量，以及血清内IL-10水平，发现IL-10/STAT3信号通路被显著激活；阻断IL-10/STAT3通路后，可显著改善淋巴细胞凋亡，恢复T细胞辅助因子1和T细胞辅助因子2(Th1和Th2)的失衡水平，并促进白细胞介素-12(IL-12)的生成。说明IL-10/STAT3信号通路为慢性应激诱导免疫抑制的重要靶点。其中，Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和p38丝裂原活化蛋白酶(p38 mitogen activated protease,p38 MAPK)被证实在此通路的激活中起关键作用。除IL-10/STAT3信号通路外，Zhang H J等[29]发现慢性束缚应激小鼠脾脏内转化生长因子β1/白细胞抑制因子2/3/叉头框蛋白p3(Foxp3)(TGF-β1/Smad2/3/Foxp3)轴被显著激活。通过抑制TGF-β1/Smad2/3/Foxp3轴或p38蛋白后，可降低淋巴细胞凋亡，下调凋亡相关蛋白的表达和减轻T调节细胞的分化紊乱。说明TGF-β1/Smad2/3/Foxp3通路涉及慢性应激诱导的免疫抑制过程。同时，Toll样受体9(TLR9)和p38 MAPK为激活此通路的核心功能蛋白。此外，Li H等[30]对比研究了慢性束缚应激对TLR9基因敲除型和野生型小鼠的作用，发现与野生型相比，TLR9缺失型血浆皮质酮水平显著降低，未表现Th1和Th2的水平失衡结果。说明TLR9的缺失抑制了慢性应激诱导的免疫抑制过程。以上研究表明，IL-10/STAT3通路和TGF-β1/Smad2/3/Foxp3轴可能在慢性应激状态下脾脏的免疫应答中扮演重要角色，其中细胞表面受体TLR4和TLR9以及p38 MAPK蛋白在相应信号通路的激活中起到核心作用。

研究表明，在慢性应激刺激下，B细胞上的2型受体(CRHR2)可与过量释放的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)结合，从而激活诸多信号传导途径(如p38 MAPK等)，并调节B细胞活力，发挥相应的免疫调节功能[31]。脾脏除含有大量B淋巴细胞外，还含有众多的T淋巴细胞，不仅B淋巴细胞在慢性应激的动物体内发挥免疫调节功能，T淋巴细胞及其亚群也同样扮演着重要角色。据报道，研究人员利用流式细胞术，研究慢性束缚应激小鼠脾脏内CD4+CD25+的调节性T细胞(Tregs)、CD4+CD25-的效应性T细胞(Teffs)和CD4-抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APCs)的生物特性，发现慢性束缚应激可显著增加Tregs比例，增强Tregs抑制活性，减弱Teffs增殖活性，降低APCs饲养活性，推测Tregs比例和活性的增加，协同Teffs和APCs的活性降低，可能是造成慢性束缚应激动物免疫功能障碍的主要原因[32]。在相关研究中，专家通过建立小鼠慢性应激模型，监测小鼠行为学和脾脏内T淋巴细胞及其亚群的变化，发现Tregs的比例与蔗糖偏好程度呈负相关，Th17细胞的增殖与蔗糖偏好程度呈正相关，血清TGF-β水平出现升高，据此，研究人员推测慢性不可预知应激小鼠的行为改变，可能与Tregs和Th17细胞的失衡密切相关，其中TGF-β可能是其中关键细胞调节因子[33]。

3 展望

除前面已概述的慢性应激与脾脏的相关作用机制外，在人和动物体中，慢性应激很多时候会作为其他疾病的诱发因素、联合因素、甚至进展因素，于是，在动物实验模型中出现了很多复合疾病模型，如肺挫伤/失血性休克(LCHS)合并慢性应激模型[34]，慢性不可预知环境压力与糖尿病模型[35]等，这使得研究模型更贴近临床实际。

脾脏是机体重要的免疫器官，慢性应激可引起机体免疫抑制，但慢性应激与脾脏相关研究较少，致病机理尚未明确，因此，机制的研究仍是目前研究的主要方向。与此同时，可以从其他实质性脏器慢性应激模型研究中汲取思路以及优化疾病模型等角度同时开展试验，扩展对慢性应激与脾脏研究的广度和深度，为疾病治疗提供更多的理论依据。