病毒与宿主蛋白互作研究技术进展

石金凤，丁 媛，陈子杨，王 琦，徐新悦，周泓名，马一丹，焦国财，李健明,3,5，时 坤,3,5*，杜 锐,3,4,5*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春 130118；2.吉林农业大学中药材学院,吉林长春 130118；3.梅花鹿药用资源利用关键技术研究室,吉林长春 130118；4.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118；5.吉林省梅花鹿高效养殖和产品开发技术工程研究中心，吉林长春 130118)

蛋白质在生物体内执行多种重要功能，超过80%的蛋白质在执行其功能时会与其他蛋白质发生相互作用，这些相互作用被称为蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)[1]，通过在两个或多个蛋白质分子间建立的高度特异性的物理接触，参与多种生物学过程，包括信号转导、免疫应答、细胞增殖、DNA复制和转录等。病毒性疾病给全世界养殖业造成了严重的经济损失，了解病毒的感染和致病机制对于病毒性疾病的防治非常必要。与真核细胞相比，病毒由有限的蛋白质组成，其与宿主蛋白建立了多种相互作用，使其能够调控受感染的细胞，可能诱导细胞产生凋亡、增殖、代谢失衡和迁移率改变等。因此，了解病毒感染期间与宿主蛋白的相互作用有助于进一步了解病毒感染和致病机理，开发新的治疗方法和免疫策略[2]。目前已开发出多种方法来辅助PPI的研究，每种检测方法均有自身的优势和局限性，侧重于PPI分析的不同方面，论文综述了主要的PPI研究方法。

1 表面等离子体共振

表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)已成为研究生物分子互作不可替代的技术之一，广泛用于研究具有生物学意义的多种相互作用伙伴，如蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、酶-底物和受体-药物等[3]。对比传统荧光、酶和放射性同位素标记分析，SPR技术增强了实时、无标记分子识别功能，可实时监测生物分子间相互作用[4]，且灵敏度高、可重复性强。获得的PPI动力学和热力学等参数，对于理解蛋白质在不同生理过程中的作用至关重要。该技术对样品需求量少，可与脂质和去污剂相容，适合膜蛋白的研究。但高灵敏度也是它的缺点之一，易产生假阳性，建议在使用SPR检测前，先使用其他方法确定交互作用。另外，分析物与芯片可能发生非特异性结合，可通过降低分析物浓度来避免。

随着SPR成本的不断降低，该技术正迅速成为研究蛋白质间相互作用、目标蛋白质-药物相互作用以及小分子抑制剂的金标准。磷酸化是蛋白质重要的翻译后修饰，与细胞信号传导和调控作用相关，Wu L等[5]利用SPR实时监测几种蛋白激酶对p53蛋白位点特异性磷酸化的作用，监测其与MDM2蛋白的相互作用，又对Nutlin-3治疗前后癌细胞中p53-MDM2复合物和caspase-3水平进行监测[6]，结果显示，Nutlin-3处理后MCF-7和MDA-MB-231癌细胞的凋亡均分别遵循p53依赖性。表明SPR技术对于检测蛋白质的磷酸化、揭示蛋白质翻译后修饰机制和区分Nutlin-3介导的p53依赖性或p53依赖性凋亡途径具有广阔的应用前景。研究表明，小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)血凝素(H)蛋白通过与细胞受体的结合介导病毒感染细胞的过程。2018年，Meng X等[7]通过使用SPR检测出PPRV的血凝素H分别与融合蛋白F、HRA和HRB存在相互作用，与HRA相比，HRB在病毒融合过程中发挥更重要的作用。2019年，Meng X等再次通过SPR和Co-IP鉴定了与PRRV血凝素蛋白和细胞受体互作有关的氨基酸残基[8]，这些发现增进了人们对PPRV感染机制的进一步了解。

2 免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)是以抗原和抗体之间的专一性作用为基础，用于研究体内蛋白质相互作用的经典方法[9]。Co-IP在接近自然的生理条件下检测蛋白质间的相互作用，可检测微弱或瞬时的蛋白质互作。抗体选择灵活，可使用特异性或添加标签的抗体。该测定法的缺点包括不适合大规模蛋白质互作筛选，不能证明两个靶蛋白的交互是直接发生的，在结合过程中可能存在其他分子(蛋白质、DNA或RNA)的参与。细胞裂解物的制备过程中，人为操作也可诱导产生生理上无关的蛋白质相互作用。

作为细胞内寄生物，病毒依赖宿主细胞的结构和功能完成其增殖等过程，通过调节细胞翻译机制来实现自身的有效复制。研究表明，核糖体生物发生因子(ribosome biogenesis factors，RBFs)和核糖体蛋白(ribosomal proteins，RPs)在病毒转录的选择性翻译中发挥多方面的调节作用。Chen Y等[10]利用免疫共沉淀与质谱联用的方法得出核糖体蛋白L4(ribosomal protein L4，RPL4)与传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)结构蛋白VP3存在相互作用，抑制RPL4表达后，病毒的VP3蛋白表达量和病毒滴度均降低，推测RPL4参与IBDV的复制过程。Kim J等[11]利用Co-IP研究表明，人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)Tat与核糖体蛋白S3(ribosomal protein S3，RPS3)发生相互作用，在有丝分裂期间通过互作作用，干扰RPS3定位来抑制细胞增殖。此外，RPS3在细胞周期的G2/M期与α-微管蛋白相互作用，RPS3的降低会损害微管的拆卸。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)是口蹄疫的病原体，结构蛋白VP1在FMDV感染期间发挥重要作用。宿主核糖体蛋白SA(ribosome protein SA，RPSA)是登革热病毒和经典猪瘟病毒感染的病毒受体。Zhu Z等[12]利用Co-IP确定FMDV的VP1与RPSA相互作用，RPSA在FMDV感染期间负调节MAPK途径的激活，并显示出抗病毒功能，FMDV VP1与RPSA相互作用，以消除RPSA介导的MAPK途径激活中的抑制作用来促进病毒复制。以上研究表明，病毒蛋白与细胞蛋白的相互作用对制定抑制病毒增殖的策略至关重要。

3 谷胱甘肽转移酶沉淀试验

谷胱甘肽转移酶沉淀试验(Glutathione S-transferase pull-down，GST pull-down)是一种直观、快速、体外检测PPI的方法，由“诱饵”(在大肠埃希氏菌或杆状病毒表达系统中表达的GST标签融合蛋白)和“猎物”组成，猎物可能是已知的纯化蛋白或粗提物中的未知蛋白[13]。可通过调节纯化蛋白的浓度以提高GST pull-down试验的灵敏性，也可通过调节诱饵蛋白的浓度评估猎物蛋白的结合亲和力[14]。纯化的蛋白质可通过在细菌、酵母和昆虫细胞中表达获得，避免了降解的风险。该方法的缺点包括获得纯化的蛋白质，其克隆、表达的过程会花费大量时间。GST标签与“诱饵”蛋白融合后，可能会影响蛋白质整体的折叠和结合能力，可能形成包涵体，阻止活性蛋白的纯化。诱饵和猎物蛋白的浓度可能与细胞中的浓度不一致，猎物蛋白与支撑物或GST标签本身发生非特异性结合，都可能增加假阳性风险[15]。GST pull-down与Co-IP相似，均使用亲和配体捕获相互作用的蛋白质。区别在于，Co-IP使用固化抗体来捕获蛋白质复合物，GST pull-down则使用纯化并标记的蛋白质作为“诱饵”结合相互作用的蛋白质。

GST pull-down在病毒-宿主蛋白间的研究中发挥了重要作用。Song Z等[16]鉴定了猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)M蛋白与真核翻译起始因子4-alpha(eukaryotic initiation factor 4A2，EIF4A2)之间的相互作用，发现抑制EIF4A2表达会显著降低病毒滴度并下调M蛋白的表达，表明EIF4A2在TGEV复制中发挥重要作用。 Yuan P等[17]鉴定了TGEV S1与UBXN1间的相互作用，TGEV感染后会引起IPEC-J2细胞感染后期UBXN1表达水平的增加，抑制细胞中UBXN1表达会显着降低病毒滴度并下调S1的表达，UBXN1过表达则会显著增加病毒拷贝数。两者均利用GST pull-down技术研究TGEV M或S蛋白与肠道细胞之间相互作用的机制，为进一步理解冠状病毒的复制、开发防控TGEV感染的新型制剂提供了参考。

4 酵母双杂交技术

1989年，Song和Fields首次提出酵母双杂交(Yeast two hybrid，Y2H)技术，其利用重组转录因子GAL4报告基因的激活来检测PPI[18]。GAL4由DNA结合结构域(binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)构成，BD和AD分别是具有独立功能的结构域，BD可与上游激活序列UAS结合，AD能激活UAS下游的基因进行转录[19]。将诱饵蛋白(X)融合到BD载体上，猎物蛋白(Y)融合到AD载体上，当诱饵蛋白与猎物蛋白发生互作时，BD和AD也会随之牵引靠近，恢复它的功能，激活下游报告基因的表达，表达报告基因，通过重构分裂转录因子活性的能力来检测两种蛋白质的相互作用。

Y2H方法简单、体系成熟、成本低，可有效检测弱或瞬态的二元相互作用，但不能提供互作结构域的精确信息[20]。该系统灵活性强，可用于大规模PPI筛选，也可用于特定小规模实验室PPI的研究[21]。其测定的PPI是在胞内进行的，避免了与细胞裂解有关的影响。但Y2H技术要求诱饵-BD和猎物-AD融合蛋白靶向酵母核，可能无法检测到细胞核外的蛋白互作，目前开发了基于分离半泛素融合的膜系统酵母双杂交解决了此问题[22-23]。也有研究表明，Y2H的假阳性、假阴性率偏高，建议通过其他方法辅助验证[24]。

Y2H技术对于多种不同蛋白质具有很高的通用性，适合实验室的筛选研究。郑博伟[25]利用Y2H筛选出了12种与肠道病毒HY12毒株结构蛋白VP1互作的宿主蛋白，为研究VP1蛋白在病毒入侵机体过程中发挥的作用，最终为阐明肠道病毒感染机制奠定基础。张兰桥等[26]研究了胞内劳森菌(Lawsoniaintercellularis，LI)外膜蛋白LI0902与猪肠上皮细胞的相互作用，筛选出3种互作蛋白，为揭示增生性肠炎的发病机理提供了线索。产气荚膜梭菌产物β2毒素在仔猪肠炎中起关键作用，曾秀等[27]为研究该毒素侵入宿主细胞的作用机制，利用Y2H技术筛选鉴定了与β2毒素相互作用的猪肠上皮细胞蛋白半乳糖凝集素(galectin-1，LGALS1)，为研究β2毒素的致病机制奠定了基础。研究表明，真核延伸因子1A(eukaryotic translation elongation factor 1A，eEF1A)不仅参与翻译过程，还可阻止细胞凋亡并促进病毒复制，参与多种病毒的转录、翻译、复制等过程[28]。利用Y2H系统，Zhang Z等[29]筛选出FMDV 2B与真核延伸因子1 eEF1G亚基的C末端区域的氨基酸208-437相互作用，此发现有助于阐明FMDV感染和复制的机制。Li S等[30]也利用该技术确认宿主蛋白eEF1A与猪瘟病毒NS5A间的相互作用，eEF1A对该病毒的增殖发挥负调控作用。以上研究表明，eEF1A蛋白不仅可能在细胞凋亡中发挥重要作用，在病毒感染过程中也可能发挥重要调控作用。

5 其他筛选蛋白互作方法的研究进展

1985年，Smith G P首次提出噬菌体展示技术(phage display technology)[31]，该技术广泛用于体外靶向特异性肽、蛋白质、抗体等筛选[32]。与其他检测技术相比，噬菌体富集提高了鉴定未知诱饵结合多肽的效率、准确性和灵敏度。基于细菌开放阅读框(open reading frame，ORF)的噬菌体展示技术的主要缺点是噬菌体表面展示的蛋白质缺乏适当的翻译后修饰，糖基化依赖性蛋白质-蛋白质相互作用,可能无法通过ORF噬菌体展示技术鉴定。

共振能量转移技术广泛用于PPI研究。荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)中的供体荧光团处于激发态时可将其激发能非辐射地转移到相邻的受体荧光团上，从而导致受体发射其特征荧光[33]。与生物化学方法相比，FRET以光学方式进行，对活细胞几乎无损伤。生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)与FRET原理相同，均对1 nm～10 nm范围内的供体和受体偶极子高度敏感，可监测分子间产生的各种生化活动，如蛋白质间的相互作用、构象变化、细胞内的离子浓度和酶活性，可检测到有关互作蛋白的亲和力、活化能和动力学等数据。BRET使用生物发光技术，不需要供体使用激发光源及相应系统，比FRET更具优势。荧光蛋白对局部环境(pH、离子浓度、氧化和温度)的变化敏感。供体和受体偶极子之间的方向可能影响信号传输[34]，造成假阴性，荧光标签有时会影响亚细胞位置和蛋白质构象。此外，所需设备昂贵，不易在实验室普及。

邻近连接技术(proximity ligation assay，PLA)可用于高度特异性、灵敏性地研究蛋白质与蛋白质之间的互作，与仅显示蛋白质共定位的传统免疫细胞化学方法不同，其使用荧光探针可视化PPI过程[35]。PLA使用两种抗体识别同一蛋白的不同表位，增加蛋白特异性。试验材料简单、成本低，仅需要两种不同物种的靶标特异性抗体(如鼠源和兔源)和特定寡核苷酸共价连接的一组二抗，即可检测内源性蛋白质之间相互作用[36]。但抗体和探针结合其靶标过程需要对细胞进行透化处理，会破坏细胞样品的活性。

6 展望

在病毒感染过程中，病原体和宿主蛋白都在不断竞争结合伴侣。一方面，研究表明，检测病毒与宿主之间的PPI，可鉴定出病毒感染所需的宿主因子，有助于建立对病毒感染机制的进一步理解。另一方面，可鉴定出对病毒感染具有重要意义的宿主蛋白质，发现更有效的潜在药物靶标去预防或治疗病毒性疾病。随着蛋白质组学领域研究的飞速发展，已开发出多种有效方法来检测蛋白质间的相互作用。生物物理方法随着科学仪器的改进而不断更新，在研究PPI的流体动力学和热力学方面显示出良好的性能；生化方法(如Co-IP)常与质谱技术联用，用于鉴定目标蛋白的结合伴侣；基因组学帮助构建了基因组规模的cDNA和ORF文库，Y2H、噬菌体展示和蛋白质微阵列等高通量遗传方法，促进了大规模的PPI研究。但所有研究方法都存在其自身的优势和局限性，可能导致在检测过程中出现假阳性或假阴性，因此建议将多种方法联合使用对PPI进行验证，以产生可靠的结果，如通过遗传方法筛选潜在PPI后，通过生物化学或生物物理方法进一步分析验证。随着科学研究水平的提高和科研能力的不断提升，在不久的将来，可能不需要添加标签、标记和固相等额外介质，就能简单、高效地获得有关病毒-宿主蛋白相互作用的相关数据，进一步加速病毒感染机制的研究。