鸭疫里默氏菌毒力相关因子研究进展

李林林，孙敏华，董嘉文，张俊勤，黄允真，黄 瑜，廖 明

(1.广东省农业科学院动物卫生研究所/农业农村部兽药与诊断学科群广东科学观测实验站/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640；2.福建省禽病防治重点实验室/福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州 350013；3.广东省农业科学院，广东广州 510640)

鸭疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)可感染雏鸭、雏火鸡、鹅等多种禽类，引发高致病性、接触性传染病。本病最早于1932年发现于美国纽约州的长岛，其后在英国、加拿大、前苏联、澳大利亚等国亦有发生。我国于1982年首次报道有该病的存在。鸭疫里默氏菌病也称鸭传染性浆膜炎(Infectious serocitis，IS)，该病主要感染1周龄～8周龄，尤其是2周龄～3周龄的雏鸭，引起多发性、渗出性炎症和全身性败血症。病变主要以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征。鸭疫里默氏菌病发病率可达90%以上，病死率高达75%。目前，该病在世界范围内广泛流行，是危害养鸭业最为严重的细菌性传染病之一，给养鸭业造成巨大经济损失。

鸭疫里默氏菌为革兰氏阴性菌，其菌体细胞壁表面多糖抗原具有多样性使得该菌的血清型呈多态化。目前确定的鸭疫里默氏菌有20多种血清型，且不同地区流行的血清型存在较大差异。血清1型、2型、10型菌株是近年来国内的优势流行菌株。不同血清型之间缺乏交叉免疫保护性，生产中多见多种血清型混合感染且新血清型不断出现的情况，给该病的防控造成很大困难。

病原菌致病是细菌与宿主复杂相互作用的结果。一方面细菌通过表达、分泌多种毒力因子入侵宿主、逃避宿主免疫系统的捕杀并完成在宿主内的繁殖，另一方面宿主通过其防御系统抵抗这些毒力因子的作用。为有效防治鸭疫里默氏菌病，需要深入研究该菌感染的分子机制和毒力因子。近年来，随着研究的深入，越来越多的RA毒力相关因子被发现和报道[1]。

1 细菌外膜相关组分

1.1 外膜蛋白

外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分，位于病原菌表面，也是最先与宿主细胞相互作用的部位，在维持菌体自身结构及物质转运、致病等方面发挥着重要作用。OMPs还具有较强的免疫原性且能诱导保护性免疫反应[2]。非菌毛黏附素——外膜蛋白A(OmpA)是一种多结构域蛋白，存在于大多数革兰氏阴性菌的外膜中。OmpA蛋白是鸭疫里默氏菌中最早被鉴定的、具有免疫原性的主要外膜蛋白[2]。研究发现，RA野生株Th4的OmpA基因缺失株Th4ΔompA对Vero细胞的黏附入侵能力显著低于野生株，且Th4ΔompA对10日龄樱桃谷鸭的致死力较野生株下降了10倍以上[3]。表明OmpA是RA的一个重要毒力因子。

1.2 表面多糖

1.2.1 脂多糖生物合成相关因子 细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又称内毒素，是革兰氏阴性菌胞壁特有的组分。在感染过程中，LPS可激活炎性细胞释放多种炎症因子，导致多种生理和病理损伤。LPS由3种不同的成分组成，即脂质A、O抗原和核心寡糖。研究发现，RA Yb2株AS87-04050基因编码LPS。通过转座子插入诱变技术使AS87-04050基因失活，银染鉴定突变株RA2640的LPS形态与野生株不同，在形态结构上由光滑型变为粗糙型；RA2640较野生株对抗生素、消毒剂和正常鸭血清的敏感性更高，且RA2640的毒力降低了10万倍以上。表明RA AS87-04050基因与RA LPS的生物合成有关，并影响RA的致病性和毒力[4]。

研究者通过构建RA Tn4351转座子突变文库，分别筛选到RA CH3菌株M949-1360、M949-RS01035、M949-RS01915基因的缺失突变株RAΔ604、RA1062、RA1067。突变株RAΔ604不能产生LPS，对Vero细胞的黏附入侵能力较野生株下降，且对鸭的半数致死量(median lethal dose，LD50)比野生株高了200倍[5]。突变株RA1062与抗CH3 LPS单克隆抗体作用无反应，LPS表型较CH3野生株粗糙，且对补体依赖性杀伤的敏感性更高，血液细菌载量降低，毒力减弱[6]。M949-RS01915基因参与RA LPS O抗原的合成，其基因缺失突变株RA1067的LPS与野生株相比存在缺陷；RA1067生长较野生株慢，对补体系统更加敏感，对Vero细胞的黏附和侵袭能力均下降，感染鸭血液中菌量也明显降低，毒力下降了360多倍[7]。以上结果表明RA CH3菌株的M949-RS01915、M949-1360、M949-RS01035基因也与RA LPS的生物合成和RA的毒力有关。

1.2.2 荚膜多糖生物合成相关因子 荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是位于细菌最外面的一层厚度不定的黏液物质，主要由酸性多糖组成。CPS直接与细菌所处的环境接触，可保护细菌细胞免受宿主免疫机制的影响，包括抗吞噬和抗溶菌活性、免疫逃避和免疫调节，且CPS还具有免疫原性。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli) Wza是一种保守的外膜脂蛋白，参与1族CPS通过外膜的输出，而Wzc是一种内膜酪氨酸自激酶。Wza-Wzc复合物可以跨越周质，连接内外膜，提供1族CPS输出途径，调节1族CPS的合成和输出。研究发现,RAwza缺失突变株未能产生CPS，缺失株具有更强的疏水性，更易自聚集，形成更多生物膜，毒性比野生型要低[8]。还发现RAwza和wzc双基因缺失影响了荚膜的生成、输出和细菌的生长，导致表面疏水性、自凝集能力、生物膜形成能力增强，降低了RA的致病性[8]。以上结果表明，wzc与wza均参与CPS的合成与输出，并影响RA的毒力。

2 细菌获铁系统相关因子

铁是大多数细菌的基本元素，铁离子是病原菌重要的生长因子。细菌的获铁系统在其感染宿主及致病过程起着重要作用。细菌获铁系统的蛋白同时也是重要的毒力因子。

2.1 TonB蛋白

TonB蛋白是革兰氏阴性菌细胞外膜的一种蛋白，参与铁等物质的运输。革兰氏阴性菌在生长繁殖过程中需要从外界摄取营养物质。一些小分子营养物质可以自由地通过革兰氏阴性菌的细胞膜，而一些大分子营养物质的转运需要特异性的TonB复合物依赖性外膜受体进行转运。TonB复合物由TonB、ExbB、ExbD构成，ExbB和ExbD蛋白质将TonB锚定在细胞质膜中，而作为能量传递蛋白的TonB作为二聚体跨越周质空间，与高丰度的外膜受体相互作用。TonB蛋白已被证明对许多细菌病原体的毒性至关重要。

RA预计包含2个TonB-ExbB-ExbD系统[9]，即ExbB1-ExbD1-TonB1和ExbB2-ExbD2-ExbD29-TonB2。研究发现，RA CH3 株TonB1、TonB2基因缺失株CH3△tonB1、CH3△tonB2对Vero细胞的黏附和侵袭较亲本株显著降低，在雏鸭体内的LD50分别比CH3野生株高224倍和87倍，感染后雏鸭血液细菌载量均较CH3亲本株显著降低[9]，表明TonB1和TonB2蛋白都影响RA的毒力。在L-半胱氨酸存在下，RA CH3可以利用血红素作为唯一的铁源，但CH3△tonB1出现血红素铁获取缺陷；进一步通过构建双突变体系统发现，只有当tonB1和tonB2都被突变时，RA CH1株血红素转运才被完全取消[9]，表明TonB1和TonB2蛋白还通过参与血红素在RA中的转运，影响细菌获铁功能和毒力。

2.2 TonB依赖受体TbdR1

TonB依赖受体TbdR1是TonB系统中的一种外膜受体， TbdR1通过与TonB复合物相互作用，参与血红素铁的获取[10]。研究发现，在低铁环境下，RA CH3株tbdR1基因缺失株CH3△tbdR1比野生株和回补株生长速度慢，生物被膜形成能力较野生株显著降低，毒力也远远低于野生株[10]，表明 TbdR1 是鸭疫里默氏菌的一种毒力因子。

2.3 铁载体相互作用蛋白

铁载体相互作用蛋白(siderophore-interacting protein，sip)参与调控铁载体基因的转录翻译过程，在铁离子转运的过程中起着重要作用。研究发现，RA CH3 株sip基因缺失突变株CH3△sip在限铁的条件下生长增殖缓慢且生物膜形成减少，对Vero细胞的黏附和入侵能力降低，对小鸭的LD50是亲本株的 35 倍[11]。还发现23/24(95.83%)RA强毒株具有sip基因[11]。以上结果表明，sip基因参与了RA的铁吸收且与RA的毒力相关。

除TonB、TbdR1和SIP外，据报道，RA血清1型菌株CH-1的B739-1343(编码 TonB 依赖性的转铁蛋白)，B739-1208(血晶素受体基因)基因编码蛋白与铁的摄取有关[12-13]。研究发现，CH-1株B739-1343基因缺失株CH-1ΔB739-1343在缺铁环境下较亲本株生长受到明显抑制，且对鸭的致病力明显降低[12]。CH-1 株的B739-1208基因缺失株CH-1ΔB739-1208也丧失了对铁的摄取能力，生长能力和毒力较亲本株显著下降，感染后鸭血液、肝脏、脑组织的菌载量都显著降低[13]。以上结果表明B739-1343、B739-1208基因与RA的毒力相关。

3 细菌分泌系统相关因子

致病菌毒力因子的释放有赖于专属的分泌系统，许多革兰氏阴性细菌通过分泌系统将毒力因子从细菌的胞内分泌到宿主细胞或者环境中。已发现的革兰氏阴性细菌分泌系统有9个(Ⅰ型到Ⅸ型)。sprT、sprA基因是Ⅸ型分泌系统(T9SS)组成元件，研究发现，RA基因缺失株ΔsprT和ΔsprA对10日龄雏鸭的毒力均较亲本株显著下降，血液和脾脏组织中菌载量较亲本株低，且对鸭血清杀菌活性的敏感性较亲本株高[14]。通过构建RA Yb2菌株Tn4351转座子突变文库，筛选到与滑行运动及Ⅸ型分泌系统相关的gldG、gldK、gldM、gldL、gldN基因缺失株[15-20]。毒力测定结果显示，缺失株Yb2ΔgldG、Yb2ΔgldK、Yb2ΔgldM、Yb2ΔgldL、Yb2△gldN、Yb2ΔgldL-gldN毒力较Yb2亲本株分别下降了2 953倍、7 009倍、184倍、48倍、54倍、110倍[15-20]。缺失株Yb2ΔgldK、Yb2 ΔgldM、Yb2ΔgldL、Yb2△gldN、Yb2ΔgldL-gldN感染鸭组织中的细菌量均较亲本株显著降低[17-19]，缺失株Yb2ΔgldK、Yb2 ΔgldM在滑行运动和蛋白质分泌方面存在缺陷[16-17]。对RA CH-1 的gldK基因缺失株进行研究也发现，CH-1ΔgldK感染后鸭血液、肝脏、脑组织的菌载量明显低于野生株，对鸭的LD50约为野生株的1.5×103倍，且对鸭的致死率显著低于野生株[20]。以上结果表明sprT、sprA、gldG、gldK、gldM、gldL、gldN基因与RAⅨ型分泌系统相关，Ⅸ型分泌系统与RA的毒力有关。

4 细菌调控相关因子

铁摄取调节(ferric uptake regulator，Fur) 蛋白可调控细菌对铁的摄取和利用，同时对广泛细胞过程(氧化还原胁迫反应、毒素与毒力因子)具有调控作用。研究发现，RA Fur缺失突变株感染产生的病理损伤较野生株轻，且毒力降低[21]，提示Fur蛋白与RA的毒力相关。通过生物信息学分析发现RAYM-RS09735和RAYM-RS09740是1对PhoP/PhoR双组份调控系统。RAYM-RS09735/RAYM-RS09740双基因缺失突变株的LD50> 1011CFU，且缺失株在心脏、大脑、肝脏、血液和脾脏中的菌载量显著低于野生型，感染雏鸭后毒力显著降低[22]，表明该双组份调控系统与菌株的毒力有关。预测发现信号转导反应调节因子(ArsR)和信号转导组氨酸激酶(SthK)位于同一操纵子上。通过构建ArsR/SthK双基因缺失突变株，发现该缺失突变株对鸭的毒力下降[23]，提示ArsR/SthK双组份与RA的毒力有关。

5 其他

LuxE基因编码酰基蛋白合成酶(luxE)，该酶激活脂肪酸，形成脂肪酰AMP介导物，并作为生物发光脂肪酸还原系统的第二步发挥作用。研究发现，luxE基因缺失株Yb2ΔAS87-03730在TSB中的生长速度和对Vero细胞的侵袭能力均较亲本株显著降低，LD50约为亲本株的80倍，提示AS87-03730与RA的毒力相关[24]。

烟酰胺酶A(PncA)是催化烟酰胺转化为烟酸的关键酶，是NAD挽救途径中的一个重要反应，影响病原体在细胞内的复制和传播。通过转座子技术获得pncA(AS87 U 01735基因编码)基因缺失株Yb2ΔpncA，与野生株Yb2相比，缺失株Yb2ΔpncA感染鸭血液中的细菌含量较低，心脏、肝脏和脾脏没有明显的组织学变化，对Vero细胞的黏附入侵能力下降，对鸭的毒力下降了488 000倍[25]。表明AS87-03730与RA的毒力相关。

RIA-1614基因(RanB)是RA菌ABC的外排泵组分。研究发现，RA-GD菌株的RIA-1614基因缺失株RA-GD△RIA-1614的LD50值是亲本株的43倍，感染雏鸭后的血液细菌载量比亲本株降低了38倍，提示RIA-1614蛋白参与了菌株的毒力[26]。

除去以上概述的各种毒力相关因子，已报道的RA毒力相关因子还有CH3株M949-RS00050基因[27]、Yb2株AS87-RS09170(bioF)基因[28]、CH-1株B739-0373基因[29],CH-1株dps基因[30]等。

6 小结

鸭疫里默氏菌作为重要的水禽细菌病病原之一，一直受到研究者的高度关注。该菌引发的疫情多发生于鸭群，但近几年鹅群暴发该病的报道逐渐增多。虽然商品化的RA疫苗已经广泛应用于水禽养殖，但生产中该病仍较多发生。且由于抗菌药物的不规范使用导致耐药菌株持续增加，使得RA在水禽养殖中的感染更为普遍和严重。

近年来，越来越多的鸭疫里默氏菌毒力相关因子被发现和研究，基于毒力因子的基因缺失疫苗研究也在不断探索。由于RA的毒力因子多种多样，不同毒力因子在致病过程中发挥的作用也不同。目前很难确定哪种毒力因子在致病过程中占主要地位，且毒力因子在细菌致病过程中的协同作用也需进一步明晰。鉴于细菌毒力系统的复杂性，未来仍有很多问题需要解决。因此，需要进一步探究已知毒力因子的功能，探索已知毒力因子在致病过程中的协同作用，以及鉴定新的毒力相关因子，为阐明RA的致病机制、防治措施提供依据，同时也为新型药物和疫苗的研发提供新的思路。