牛结核病的诊断与疫苗研发现状

李瑞乾，宋阿北，魏硕彤，谢 婧，缪西鹏，马佳睿，许立华

(宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分支杆菌(M.bovis)引起的一种严重的人兽共患传染病。牛分支杆菌易感染牛，其次是人、禽类和野生动物等[1]。该病主要通过呼吸道传播，还可通过食用带菌的生肉或乳产品通过消化道传播。被感染动物主要表现为逐渐消瘦、低热并伴有咳嗽和呼吸困难等症状。由于我国各地牛的交易频繁，这可能会导致牛结核病在我国的流行，且得不到有效的控制，影响我国畜牧业的发展并对人民的健康构成威胁。目前，西方发达国家采取检疫、扑杀等有效措施可有效缓解牛结核疫情[2]。近年来，随着社会经济的快速发展，人类对乳制品需求的增加和人民生活水平不断提高的同时，加剧了牛结核病在全球化的快速发展。因此，全世界需要高度重视牛结核病，通过加强科学研究来有效抑制疫情的发生。随着分子生物学及基因工程技术的发展，牛结核病诊断技术和疫苗种类等方面都有较大的突破。本文对牛结核病的诊断技术和疫苗的开发研制现状进行总结，对养牛业的健康发展具有重要的意义。

1 牛结核病常用诊断技术进展

牛结核病的诊断是防止此病蔓延的关键一步，这在牛结核病的净化上起着至关重要的作用。目前用于牛结核病诊断的方法主要有细菌学诊断方法、分子生物学检测方法和免疫学诊断方法。

1.1 细菌学诊断方法

1.1.1 涂片染色法 涂片染色法是一种检测快速、操作简单的诊断方法。此方法要求实验人员在无菌、无污染的条件下采集可疑感染牛的病变组织进行涂片并采用齐-尼二氏抗酸染色法染色，在显微镜下观察，分支杆菌会被染成红色，而其他细菌被染成蓝色[3]。但是此方法的不足之处是实验精准性不高，适合检测数量多的组织样品，另外，被检样中若有其他杆菌存在会对结果造成干扰[4]。所以，在结核病的诊断上先用此方法做初步检测，再结合其他诊断技术做进一步的复检来提高诊断的准确性。

1.1.2 细菌培养法 细菌培养法对含量较低的结核杆菌的组织样都能准确检出，灵敏度较高。操作方法是采取病牛鼻腔中的分泌物进行细菌分离培养，培养结束后进行涂片镜检，依据细菌的形态及结构特征可以区别牛分支杆菌与其他杆菌。不足之处在于结核杆菌的培养条件较高且成功率较低，容易受到外界环境的影响，导致结核杆菌的检出率比较低[5]。此外，由于菌群在培养基上的生长速度较慢，随后还要进行药敏试验和生化试验等一系列复杂的过程。由于这些缺点，此方法在临床诊断中不被应用，而在实验室诊断中常有应用。

1.2 分子生物学诊断方法

1.2.1 聚合酶链反应 聚合酶链反应(PCR)技术是将特定的DNA片段或cDNA片段在体外一定的条件下短时间内大量扩增目的片段的分子生物学技术，具有灵敏度高、检测速度快、精确度高的优点。目前科研人员已研发出了逆转录PCR、套式PCR、实时荧光PCR等一系列敏感性高和特异性强的PCR方法。岳筠等[6]将来源于牛分支杆菌保守区域的基因合成了特异性引物，并构建了PCR来检测牛分支杆菌，将该方法用于鲜乳的分支杆菌检测中，具有较强的特异性和敏感性。高新桃等[7]为了评价血清中细胞因子IL-17的mRNA的转录水平，以重组蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)为刺激原初步建立了基于IL-17和IFN-γ转录水平的实时荧光定量PCR法对14头结核阳性牛进行检测，其IL-17实时荧光定量PCR的阳性检出率为85.7%，较高于IFN-γ(71.4%)的阳性检出率。说明建立的IL-17的实时荧光定量PCR在牛结核病的诊断上具有一定潜力。白丽娟采用16S rRNA编码基因和分支杆菌复合群菌种间具有差异的基因Rv0577、Rv3349c、RD1、RD4、RD7和RD12多位点结合PCR对100株分支杆菌进行分支杆菌种及其亚种的生物学鉴定，结果表明，其中分支杆菌复合群(MTBC)的检出率为8%(MTB的检出率为7%，M.caprae的检出率为1%，这与MPT64基因片段PCR的鉴定符合率为100%，非分支杆菌(NTM)的检出率为92%(92/100)。程成[8]采用多位点PCR法对80株临床分离株进行菌种鉴定，其中有30株属于MTBC，结核分支杆菌和牛分支杆菌分别占13.3%(4/30)和86.7%(26/30)，说明多位点PCR可重复性强，在分支杆菌的种和亚种的鉴定上值得推广。张春燕等[9]为了确定牛分支杆菌适宜的PCR扩增引物及参数，采用降落PCR来确定已报道的几对PCR引物适宜的退火温度(Tm)，并将不同的引物用于检测牛分支杆菌C68001株来确定不同引物PCR的敏感性。目前，PCR技术以灵敏度高和检测速度快等优点用于畜牧业中牛结核病的诊断之中，为了能够获得较高的准确性通常与其他检测方法结合使用。

1.2.2 DNA核酸探针检测法 DNA核酸探针检测法是将特异性DNA片段用特殊的示踪剂进行标记作为探针，在特定的条件下与待检样本DNA分子上遗传区段互补杂交来确定结核杆菌的种类。目前比较常用的探针有cDNA探针、全染色体核酸探针、寡聚核酸探针和克隆核酸探针等。目前，核酸探针法可以检测和确认出3种分支杆菌。DNA核酸探针检测法具有操作简单、所需样本量少、结果易分析、敏感性和特异性强的优点，但不足之处是需要多次杂交造成工作量较大且成本较高，在临床上不易推广应用。

1.3 免疫学诊断方法

1.3.1 结核菌素皮内变态反应 结核菌素(PPD)变态反应皮内试验自被创立以来，一直在世界各地被广泛应用[10]。抗原ESAT-6和CFP-10是结核菌素早期分泌的，为皮试反应的首选抗原。为了提高皮内变态反应检测的准确性，将Rv3615和Rv3020c用作ESAT-6和CFP-10的补充抗原[11]。该方法具有操作简单、检出率高的优点[12]，不足之处在于感染了其他病原菌的牛会出现假阳性，因此特异性较差。另外，在检测后30 d内不能重复进行试验。目前世界较多的国家都开始选择同时接种牛结核菌素和禽结核菌素的比较皮内变态反应试验，并通过两种结核菌素所产生的不同的反应来区别牛分支杆菌的感染和其他分支杆菌的感染。

1.3.2 酶联免疫吸附试验 随着牛结核病诊断技术的发展，酶联免疫吸附试验(ELISA)在牛结核病的诊断中以操作便捷、快速和灵敏度高的优点在牛结核病的诊断上被广泛应用。此方法是利用具有特异性的抗原作为ELISA的诊断抗原而建立的诊断方法。此方法不足之处在于牛分支杆菌的抗原性较弱，并与其他分支杆菌具有共同的抗原决定簇，会导致检测结果出现较多的假阳性而无法确定检测结果。因此，可以选择使用多种抗原及结合其他的诊断方法来提高诊断的敏感性和特异性。INGENASA公司建立了MPB83双识别ELISA的方法对结核病牛进行了诊断，其敏感性为79.4%。若与IFN-γ 检测法联合检测后，其敏感度可以达到95.4%[13]。周曼丽等[14]将牛分支杆菌的重要抗原蛋白MPB70作为免疫原接种免疫Balb/c小鼠，经过多次筛选获得单克隆抗体。用间接ELISA对已获得的单克隆抗体进行亚类鉴定及效价分析并成功获得了MPB70单克隆抗体，这为牛分支杆菌的检测技术奠定了基础。王康等[15]将胞内分支杆菌HBHA单克隆抗体进行包被建立了双抗夹心ELISA检测胞内分支杆菌，并检测了菌体数量为200 CFU/mL的样品，其准确度高达93.3%(56/60)。目前，研究人员已通过抗原表位分析了分泌于牛分支杆菌细胞外的蛋白，研究发现位于细菌保守区域的基因Esat6和Cfp10存在比较广泛的抗原表位，而且表达蛋白具有极强的抗原特异性，可能是免疫学诊断结核病的特异性抗原[16]。以上研究结果表明，开发适用于牛群的敏感而特异的ELISA诊断抗原具有广阔的发展前景。

1.3.3 γ干扰素试验 γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测技术是利用特定的牛结核刺激抗原,如提纯结核菌素(PPD)与体外培养的致敏淋巴细胞结合时致敏淋巴细胞会分泌出大量的IFN-γ，然后进行ELISA来检测IFN-γ的表达水平，最后得出判定结果。目前在牛结核病的诊断时，先利用PPD变态反应对牛只进行初检，对诊断为PPD阳性的牛再利用IFN-γ ELISA进行复检来排除假阳性牛只，这两种诊断方法的结合可以降低奶牛的淘汰率[17]。李昕等[18]建立了牛结核IFN-γ夹心ELISA检测方法，与PPD皮内变态反应和商品化BOVIGAMTM试剂盒同步检测了961头奶牛，其中IFN-γ夹心ELISA与PPD皮内变态反应的总符合率达到98.44%，与BOVIGAMTM试剂盒的总符合率达到99.58%。杨显超[19]建立了牛结核IFN-γ ELISPOT检测方法，经过多次试验最后评价该检测体系较为稳定。为了比较IFN-γ检测法的有效性，杨莉等[20]对某奶牛场的200头奶牛分别采用IFN-γ国产试剂盒(KIT1)和进口试剂盒(KIT2)进行牛结核病诊断，结果表明二者具有较好的一致性且符合率达到95%。虽然该检测方法较为准确、有效地诊断出结核病牛，但也存在一些不足，就是对实验人员的技术要求较高且检测成本较高[21]。

1.3.4 胶体金诊断技术 当前，免疫胶体金诊断技术作为一种新型的以免疫学为基础的检测技术在牛结核病的诊断上应用比较广泛。此诊断技术敏感性和特异性强，并能在短时间内能够得到检测结果。王凤江[22]采用MPB64免疫胶体金法和PCR扩增测序法对3株标准分支杆菌和300株分支杆菌分离株进行了检测，结果表明，MPB64免疫胶体金与PCR法检测符合率为97%，由此认为MPB64免疫胶体金检测技术有较高的特异性和敏感度。张铭锦[23]利用斑点免疫胶体晶渗滤法原理构建了结核抗体斑点免疫胶体金检测试纸条，对60只实验猴血清进行了结核病诊断。结果表明该方法特异性强、灵敏度和准确度较高，且阳性预测值和阴性预测值均较高。由于该检测技术起步较晚且开发的胶体金临床检测的试剂盒较少，目前该方法在结核病的快速诊断技术上仍然具有较大的发展潜力和应用前景。

2 疫苗研究现状

传统卡介苗(BCG) 在结核病的防控上不是最佳选择，尤其在大量牛结核病的病原菌耐药株产生后，新型疫苗的研究与开发是目前牛结核病领域比较突出的任务。

2.1 重组卡介苗

由于卡介苗(BCG) 在传代的过程中其毒力不断削减的同时抗原蛋白的编码基因也会发生突变或丢失，这使其抗原性降低。为了解决这一问题，研究人员选择结核杆菌主要保护性抗原基因转入质粒等载体形成重组卡介苗(rBCG) ，使保护性抗原能够表达并增强BCG的免疫效果。与BCG相比致病性分支杆菌缺少了RD-1区，RD-1区是由9个基因构成，即Rv3871～Rv3879c。孟凡爽[24]构建了6个RD-1区重组质粒(pMV-261-Rv3872、pMV-261-Rv3873、pMV-261-Rv3874、pMV-261-Rv3875、pMV-261-Rv3876、pMV-261-Rv3877)，并利用电转化技术获得3个rBCG(rBCG:ESAT-6、rBCG:Espl、rBCG:Snm4)，将其接种于小鼠。结果显示，免疫接种6周后试验组IgG水平明显升高，细胞免疫维持较高水平且脾细胞上清液中IFN-γ的含量显著上升，这为结核疫苗的改进提供了新的思路。rBCG的抗原保护力超过了BCG，它具有生产成本低、安全、接种动物发病率极低和稳定性强的优点。但不足在于rBCG与传统的BCG一样会对PPD试验造成干扰，且对存在免疫缺陷的个体危害性大，这限制了rBCG在牛群中的应用，目前还未见在牛群应用的报道。

2.2 减毒活疫苗

减毒活疫苗是一种通过分子生物学技术将分支杆菌菌株中毒力基因片段敲除使其毒力降低，并保留其具有免疫活性的基因片段而获得的一种更安全的疫苗。将这种疫苗接种于动物体内，由于不能正常使病原菌侵袭宿主细胞所需的蛋白得到表达而降低了对机体的感染力，从而降低了对动物的致病性而起到免疫保护作用。MTBVAC是一种敲除了基因phoP和fadD26的结核杆菌减毒活疫苗，在Ⅰ期临床试验上表现出了令人满意的效果，安全性和免疫原性较高。目前，MTBVAC的Ⅱ期剂量递增试验将在南非进行[25]。但是通过这种方法得到的疫苗目前面临着较大的问题，一方面会对PPD皮内变态反应的结果造成干扰，无法区别疫苗接种和自然感染的牛，另一方面就是易毒力返强，对接种牛的免疫效果具有潜在风险。因此，在弱毒苗的研究上仍然面临着较大的挑战。

2.3 亚单位疫苗

亚单位疫苗是利用致病菌有保护作用的蛋白经分离纯化配合免疫佐剂而制成的一种疫苗，可以选择性地增强某些抗原的免疫应答能力来提高接种动物的免疫效率。近年来，有关结核病的亚单位疫苗的研究报道较多。俞琦等[26]首先将MTO和Mv联合构建了MTOM佐剂，然后将结核杆菌融合蛋白Rv3407-Rv2626c-Ag85A-PhoY2-Ppfb(WH121)分别与Mv、MTO和MTOM混合制备出亚单位疫苗并接种于实验小鼠。结果表明，Mv和MTO混合的佐剂MTOM既能增强Th1型细胞反应，还能够诱导IL-2阳性多功能T细胞，该疫苗可以用于研发牛结核病的候选疫苗。为了筛选安全、有效的抗结核杆菌感染的亚单位疫苗，王磊等[27]选择了Ag85a、Rv3802c、Rv0394c、Rv0199、Rv2660c、Rv0125、Mpt51、TB10.4和Omp A 9个结核杆菌的重要抗原，将每3个抗原进行融合(共分7组)表达并与不完全佐剂和沙门氏菌混合后皮下免疫接种小鼠。结果表明，以上融合蛋白均能刺激小鼠产生较高水平的抗体，具有较强的免疫原性，这个试验为结核病亚单位疫苗的发展奠定了基础，是当今牛结核病疫苗研究领域的热点。

2.4 活载体疫苗

活载体疫苗是一种利用基因工程技术将常用病毒中与毒力有关的基因进行敲除而得到能够插入外源基因的病毒载体，在接种于动物机体后具有免疫原性的蛋白能够引起机体免疫效应。具有低成本、较稳定、免疫方式简单和效率高的优点。目前常用的病毒载体主要有腺病毒和痘病毒。刘鑫等[28]将牛分支杆菌的Ag85A抗原导入载体L.Lactis NZ3900，通过灌胃途径接种小鼠，能产生局部的免疫应答反应和高水平的slgA抗体。Li W等[29]构建了能够表达分支杆菌融合蛋白(AG85A、AG85B、CFP10和ESAT6)的腺病毒活载体Ad5-CEAB，滴注于试验小鼠鼻内，起到了良好的免疫保护作用。AERAS-485/MVA85A是一种能够表达结核杆菌抗原Ag85A的重组痘病毒，针对MVA85A的两个临床Ⅱ型试验均表现出了良好的免疫原性和耐受性，但没有表现出明显的免疫应答性，没有起到显著保护结核杆菌的感染的效果[30]。有些重组活载体疫苗无论是在安全性上还是在免疫保护性上都表现出优于BCG的效果，但是并没有表现出完全抵抗或清除体内结核杆菌的能力。因此，研发更有效预防结核疫苗还需要科研人员的不懈努力。

2.5 DNA疫苗

DNA疫苗与其他疫苗相比是一种相对先进的新型抗结核疫苗，也是目前牛结核病的第三代疫苗。该疫苗的原理是通过外源质粒作为载体将牛分支杆菌中具有免疫原性的基因片段进行重组，将这种重组基因通过各种技术导入动物机体细胞内并分泌出抗原蛋白，从而刺激动物机体产生一系列免疫应答，利用这种机制来达到预防牛结核病的目的。该疫苗具有安全性高、成本低、易操作且不干扰PPD皮内变态反应等优点，在牛结核疫苗的研究上具有广阔的前景。

目前，将能够表达几种蛋白的基因通过融合构建表达载体获得的DNA疫苗是当今研究的热点。粟海波等[31]基于质粒A39构建了V569(p-VAX1-Ag85B-Rv3425-PPE26-Rv2029c)DNA疫苗，对其免疫原性和保护性做初步研究，结果显示，V569能够提高小鼠的细胞免疫反应(IFN-γ分泌水平较高)，外周血液CD4+/CD8+T细胞比例显著升高，表明V569DNA疫苗可能是一种抗结核感染的DNA候选疫苗。Yan L等[32]构建了Rv3407DNA疫苗，并在试验小鼠上做了比较试验。结果显示，Rv3407DNA组中的IgG抗体水品显著升高，且出现了较显著的抗原特异性的细胞免疫和体液免疫。JIANSONG T等[33]通过密码子优化构建了BERoptDNA疫苗，通过体内电穿孔免疫Balb/c小鼠，诱导了外周血中分泌IFN-γ的CD8+T细胞，可以保护Balb/c小鼠免受高剂量致病性结核分支杆菌的攻击。因此，这种新型DNA疫苗具有较好的免疫原性和保护性，这在预防结核分支杆菌和免疫疗法上具有广阔发展前景。DNA疫苗的不足之处在于单一抗原对机体的免疫保护性不如BCG，而多价融合的DNA疫苗具有理想的免疫效果。大多数DNA疫苗在小鼠等实验动物上具有良好的免疫保护效果，而在牛上并不产生同样理想的效果，这一问题是牛结核病DNA疫苗有待突破的关键。

3 展望

目前，世界各国都高度重视此病的预防和净化，并出台了一系列的应对措施。虽然用于诊断牛结核病的方法并不唯一，但是目前并没有哪一种方法可以独立、快速、准确有效地诊断牛结核病。因此，需要将各种诊断牛结核病的技术进行结合使用，这样来提高单一诊断方法的不足，从而可以提高诊断的准确性和灵敏度。另外，开发操作简单、快速、准确和特异性强的牛结核检测技术是今后牛结核病诊断方面的重要课题。近年来科研人员研制出的亚单位疫苗、灭活苗以及核酸疫苗虽然在实验动物上起到了很好的免疫保护作用，但这些疫苗在牛群中免疫效果不尽相同，且在安全性和有效性方面还得不到可靠的保证。所以，还需要更加深入的研究，以期为牛结核病的预防提供合适、有效的疫苗,以期为根除牛结核病提供技术支撑。