宏基因组学在奶牛养殖环境中耐药性研究的应用

张向阳 ， 亢继俊 ， 张靖菊 ， 刘义明 ， 陈孝杰 ， 李秀波

(中国农业科学院饲料研究所兽医微生物学实验室 ， 北京 海淀 100044)

抗生素的发现与使用是人类历史上一次里程碑式的突破，英国细菌学家弗莱明在实验室的2次意外发现开启了抗生素治疗感染的新篇章。但是由于不规范使用甚至滥用，药物残留和耐药菌株的广泛传播严重危害畜牧业健康发展和人类公共卫生安全。近年来，科研人员已经意识到做好耐药菌的流行病学调查和监测抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)在细菌间水平转移的重要性[1]。随着测序技术的飞速发展，借助宏基因组学(Metagenomics)方法使高效快速准确地检测样品中耐药基因及发现新型耐药基因成为可能。本文将针对宏基因组技术在奶牛养殖中ARGs监测方面的应用进行阐述，以期为了解ARGs借助粪便和空气等媒介在奶牛间，以及奶牛与环境间传播扩散的规律提供研究思路。

1 细菌耐药性研究进展

自1928年弗莱明发现人类第1种抗生素青霉素以来，距今已有90多年的历史，在此期间又发现了磺胺类(1932年)、氨基糖苷类(1943年)、氯霉素类(1947年)等10多个大类的几十种抗生素[2]。抗生素成为人类抵抗病原菌感染的利器，彻底改变了现代医学，挽救了数以亿计的生命。数据表明，抗生素仍然是目前最常用的处方药之一，从2000—2015年，全球抗生素消耗量[衡量的指标为限定日剂量(Defined daily dose，DDD)]增加了约65%，从211亿增长到了348亿[3]。抗生素在养殖业中的大量使用增加了对动物肠道及环境中携带耐药基因细菌的选择性压力。有研究分析，最初的耐药基因可能是环境中产生抗生素的细菌携带，这些耐药基因从基因层面调控细菌生命活动，发挥不同的生物学功能，如外排泵、水解酶等，用以抗药自保。为了应对不断出现的耐药现状，科学家研发了第2代、第3代和第4代抗生素，但是相应的耐药基因甚至在药物研发阶段就被发现了，这些ARGs在不同菌株间随水平转移扩散范围越来越大。多重耐药菌株甚至超级细菌的相继出现提醒着我们，人类很可能会面临无抗生素可用的后抗生素时代。被誉为临床治疗细菌感染“最后一道防线”的两类药物——碳青霉烯类和多黏菌素类，也相继随着超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)[4]和黏菌素耐药基因mcr-1[5]的发现，宣告人类临床抗微生物感染的最后一道防线也即将失去。目前许多的耐药基因可以随着质粒在各种细菌间水平传播，因此做好对多种耐药基因的监测并及时采取措施，控制耐药基因随环境传播到人类体内的过程，对于保障人类免遭威胁至关重要。

临床上筛选耐药基因通常采用细菌培养法，借助多种培养基筛选微生物菌落，通过染色、生化鉴定、16S rRNA等方法进行菌株鉴定，药敏纸片法、琼脂稀释法确定菌株对不同抗生素的敏感性，得到筛选菌株的最低抑菌浓度。借助分离培养的方法鉴定耐药菌株技术成熟，准确度高，可对分离菌株进一步进行全基因组测序(Whole genome sequencing，WGS)，准确鉴定分离株的血清型及含有的ARGs，并能对菌株进行追根溯源。

目前环境中大部分细菌都无法分离培养，传统的细菌分离培养法费时费力，完全不能满足现代化大规模快速检测的需求[6]。宏基因组学的快速发展，使全面且快速地研究环境样品中ARGs在不同菌株间的传播扩散规律成为可能。

2 宏基因组学的发展现状

宏基因组学的概念最早是在20世纪90年代提出的，指的是通过提取和克隆来自环境样品中所有微生物的DNA进而对微生物的遗传物质进行分析，也叫环境基因组学、生态组学等[7]。

随着测序技术的发展，测序成本大幅降低。第1代Sanger/鸟枪法测序技术存在速度慢、成本高、通量低等方面的不足，使其并不适合广泛使用[8]。目前，宏基因组学测序分析主要采用的高通量测序技术(High-throughput sequencing)属于第2代测序技术，优势是高通量和成本低，比较代表性的有Roche公司的454焦磷酸测序(Pyrosequencing)[9]、Illumina公司的Solexa合成测序[10]和ABI公司的SOLiD连接法测序[11]等。借助这些平台可对江河湖泊[12-13]、土壤[14]、废水及排放河流[15-16]、人类和动物肠道粪便[17]等样本内的ARGs进行测序，探究ARGs在不同环境中的传播机制及对公共卫生安全的潜在威胁。随着高通量测序技术的发展，又出现了单分子实时测序的第3代测序技术。Helicos公司的遗传信息分析系统(Heliscope/Helicos genetic analysis system)[18]、Pacific Bioscience公司的SMRT(Single molecule real-time)技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子测序技术[19]，标志着第3代测序技术的诞生，第3代测序技术意味着更高的通量，更低的成本和更长的读取长度[6]。宏基因组学随着测序技术的发展优势也越来越明显，越来越广泛地被用于研究ARGs在人类、动物和环境中微生物群落间的传播进化规律，监测ARGs对公共卫生的威胁程度。

宏基因组学的主要流程包括：从环境样品(粪便、污水等)中提取所有微生物的DNA(包括不可培养细菌)；将提取的基因组DNA片段化后借助载体转化到宿主菌，构建宏基因组文库；对文库进行耐药性功能筛选，收集抗生素作用下的阳性克隆；对阳性克隆内插入基因扩增后进行高通量测序，对测序所得Reads质控处理并去除宿主序列后进行组装；对组装后的序列有两种分析思路，一种借助生物信息学方法将组装的序列与CARD(Comprehensive antibiotic research database)等抗性基因数据库进行搜索和序列比对，这种方法只能鉴定出数据库中已知的ARGs；另一种方法是将组装的Contigs进行基因预测获得开放阅读框(Open reading frames，ORFs)，功能注释筛选含有ARGs的ORFs，借助软件和隐马尔可夫模型对ARGs进行功能预测，既可以鉴定已知ARGs也可以发现新的ARGs。宏基因组学技术极大方便了科研人员对人类和动物以及环境样品中抗生素耐药性的起源、传播和进化规律进行分析，为微生物群落中新型ARGs的发现提供可能。

3 宏基因组学在奶牛耐药性研究中的应用

奶牛粪便是人类病原体的已知来源[20]。尽管在粪便中发现的大多数微生物都是非致病性肠道微生物，不易对人类健康构成重大威胁，但它们可能携带抗生素抗性基因(ARGs)传播到环境中其他病原菌体内，使越来越多的病原菌耐药[21]。奶牛是一种大型草食动物，据估计1头成年奶牛1年的粪便排泄量大约有1吨。2018年中国奶牛存栏量为720万头[22]，大量的奶牛粪便是一种潜在耐药基因污染源。借助宏基因组学使研究这些ARGs对周边的环境的影响以及传播途径成为了可能。

借助功能宏基因组学构建宏基因组文库可以功能筛选新型ARGs。以前的研究主要集中在对抗生素使用量大的动物(如猪和鸡)的粪便中ARGs的研究。虽然牛粪常用于作物生产，但其受到的关注较少。Wichmann等将功能性宏基因组学与第3代PacBio测序相结合，采集奶牛的粪便样品构建的对氯霉素、卡那霉素、四环素或β-内酰胺抗性的87个克隆中，80个携带独特的ARGs，其推导的蛋白质序列与GenBank中序列的平均相似度仅为50%～60%，借助基于蛋白质序列的系统发育树发现了一种新型的氯霉素乙酰转移酶[23]。

借助宏基因组学可以探究ARGs在奶牛养殖中的传播规律。科研人员从全国7个主要奶牛养殖省份采集奶牛粪便和奶牛场土壤样品，采用宏基因组学方法检测ARGs，发现这些样品中不仅囊括了几乎所有主要种类的ARGs，而且具有相当高的丰度，表明奶牛场是一个巨大的耐药基因传染源，并具有极强的水平扩散风险。而奶牛场普遍采用粪便堆肥更会加剧ARGs的积累和传播。另外，粪便和奶牛场土壤样品中微生物群的ARGs含量和分布呈显著正相关，表明奶牛养殖加剧了ARGs在土壤中的积累。ARGs的分布流行规律与转座酶表达丰度显著相关，表明ARGs扩散传播的潜在高风险和公共卫生隐患，揭示了动物生产—粪肥—土壤间ARGs的潜在传播扩散途径[24]。

在饲养场周围，空气中ARGs的含量会被场内使用的抗生素影响。McEachran等[25]采集了10个肉牛饲养场的下风向和上风向的空气颗粒物，采用高效液相色谱法、质谱连接法、16S rRNA扩增和测序分析等方法研究发现，产生于肉牛饲养场的空气颗粒物包含不同的细菌群落、抗生素和ARGs。多种兽用抗生素和含有ARGs的微生物群落在空气颗粒物上重新编码ARGs，具有大范围传播的巨大潜力。这些颗粒物随着空气的流动四处扩散，把养殖场中的兽用抗生素、微生物及其携带的ARGs传播到其他环境中去，包括人类生活区。这些携带ARGs的微生物在新的环境中也可能借助其他载体继续传播扩散[26]。推测有抗生素大量使用的奶牛场很有可能也存在通过空气颗粒物向外扩散ARGs的情况。

借助宏基因组学可以探究ARGs在奶牛养殖中动物之间的传播规律[27-28]。为了进一步了解断奶犊牛和泌乳母牛之间的耐药性和微生物群落之间的差异，Haley等[29]对来自17个规模化奶牛场的预断奶小牛和泌乳母牛混合粪便样品进行了宏基因组测序。结果表明，2个年龄组之间的微生物群落结构和耐药性存在显著差异。在所有样品中均鉴定出各种ARGs，其中最常检测到的是四环素和氨基糖苷类抗性基因。犊牛的混合粪便样品中ARGs的含量要比泌乳母牛的丰度和多样性更高。在耐药性种类上，小牛粪便中四环素、氨基糖苷类、甲氧苄啶、大环内酯-林可酰胺-链霉菌素B和β内酰胺类等的耐药基因的相对丰度显著高于泌乳母牛粪便。这项研究的结果表明，与泌乳母牛的粪便相比，断奶小牛的粪便中含有不同的细菌群落和耐药基因组，在断奶小牛的粪便中检测到更多的耐药基因。

4 展望

奶牛养殖会产生大量的废弃物，是一个巨大的耐药基因库。借助宏基因组学方法研究发现，在奶牛养殖中，ARGs在不同年龄的奶牛间，粪便—土壤间，以及牧场—空气间肆意传播扩散，应该引起足够重视。一方面借助宏基因组方法继续探索完善ARGs在奶牛养殖各个环节中的传播规律以及明确养殖中ARGs对周围农田、土壤、河流、植被以及人类生活的影响，另一方面提示动物养殖中ARGs的广泛传播对周围环境的污染、对人类公共健康是一个巨大的威胁，也提示动物养殖场应做好粪便污水等废弃物的净化处理工作。未来应继续探究和实践抑制养殖环境中ARGs产生与传播的方法，减缓或切断ARGs在病原菌间的传播途径，降低ARGs对公共健康的威胁。监测和应对抗生素耐药性的未来在于成功地将基于培养的细菌分离鉴定、全基因组学、宏基因组学等多种技术相结合，以快速识别和追踪ARGs的进化传播规律，为人类寻找应对措施抢占先机。