糖尿病患犬泪膜功能变化的临床观察

李 晶 ， 孙海通 ， 刘 畅 ， 庞 茉 ， 金艺鹏

(1.北京中农大动物医院有限公司 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 中国牧工商集团有限公司 ， 北京 丰台 100070 ；3.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

糖尿病是犬常发的内科病之一，糖尿病诱发眼部的病变包括白内障、角膜内皮细胞的缺失、角膜内皮的多形性、角膜敏感性降低、视网膜血管损伤如小血管瘤等，其中最常见的眼部病变是白内障。文献表明，75%糖尿病患犬在发病后12个月内出现白内障，80%糖尿病患犬在患病后16个月内出现白内障[1]。有报道显示，糖尿病患犬白内障术后溃疡性角膜炎的发病率高于非糖尿病性白内障患犬，且糖尿病患犬的角膜敏感性低于正常犬[2]。白内障相关研究推断，角膜创伤的愈合会造成角膜敏感神经及泪液产生减少，进行白内障超声乳化术后，出现干眼症并发症的概率会增加[3]。也有人提出，糖尿病等内分泌疾病诱发了自身免疫机制导致泪腺功能降低，从而影响泪液的分泌。有研究指出，在糖尿病患者体内检测出泪腺自身抗体，而对照组无泪腺自身抗体[4]。当泪膜的质量出现问题，就会诱发角膜结膜炎(又称干眼症)。泪膜覆盖眼球表面，其本身又分为3层结构，最外层是薄薄的一层油脂，是由Zeis氏腺和睑板腺分泌；泪膜的第2层为水溶液层，主要由泪腺和第3眼睑腺分泌；泪膜的第3层是黏液层，其主要成分是黏蛋白、免疫球蛋白、尿素、糖蛋白、盐、葡萄糖、白细胞、细胞碎屑和酶[5]。对泪膜的评估分为量和质两部分，其中泪液分泌试验可以检测泪液的数量，而泪膜破裂时间间接反映泪膜的质量。本试验通过探讨糖尿病性白内障犬的泪膜变化，为临床中客户教育及积极地预防或治疗性用药提供指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物 自2016年2月—2017年12月，从在中国农业大学动物医院就诊的犬中随机选取30例糖尿病性白内障犬、30例非糖尿病性白内障犬、30例非糖尿病非白内障犬。所有犬都进行详细的病史调查、血常规、生化、尿检等检查。在筛选的糖尿病患犬中，仅选择双侧眼均白内障的病例作为研究对象。对于非糖尿病犬的选择，要求其未见糖尿病临床症状、血糖正常(3.5～5.5 mmol/L)、无尿糖且在体格检查中未见其他系统性疾病。对于最近或反复发生眼部症状、有干燥性角膜结膜炎病史、具有其他系统性疾病或正在使用局部眼部用药的犬均不在选择范围内。

1.2 泪液测试(Schirmer tear test,STT) 使用同一批号的标准泪液试纸条放于下结膜囊的同一位置，即靠近外眦近1/3处进行测试，记录每只眼的泪液数量，单位是mm/min。

1.3 泪糖浓度测试 泪糖测试使用尿液试纸条进行半定量检测，将葡萄糖试纸条接触每只眼的内眦泪液半月板部位后，立即拿开且静候30 s，通过比色卡进行判读。

1.4 角膜荧光素染色(Fluorescein stain,FL) 将荧光素钠均匀分布至角膜上皮，在裂隙灯下使用低亮度钴蓝光仔细观察角膜上皮着色情况。对角膜进行0～9分的评分，其中0分表示每个象限均没有点状着色，1分为染色少于15个点，2分为中等数量且大于15个着色点，3分表示重度角膜荧光素染色即角膜表面出现块状染色或丝状染色。

1.5 泪膜破裂试验(Tear film break up times,TFBUTs) 使用洗眼液湿润荧光素染色试纸条，然后点触每只眼球背侧球结膜1次并闭合眼睑。当眼睑打开后开始计时，使用裂隙灯放大16倍在钴蓝光下观察背外侧角膜，当出现第1个泪膜破裂点(干燥点)时计时结束。

1.6 结膜细胞学 使用0.5%丙美卡因点眼局部麻醉，无菌棉签于下结膜囊内数次旋转，然后将采样拭子进行4个载玻片涂片，通过过碘酸希夫(Periodic acid-schiff,PAS)染色进行细胞学判读。

1.7 结膜病理学 由于结膜活检采样需征得宠物主人的同意，且不配合的病例需要麻醉采样，故无法对每个临床病例都进行结膜病理采样。对7例糖尿病性白内障犬进行下结膜囊内结膜活检采样，使用PAS染色评估杯状细胞(Goblet cell,GC)，计数50个上皮细胞(Epithelial cell,EC)，在这50个上皮细胞中，计数其中杯状细胞的数量(即GC∶50 EC)，重复计数2次，取GC∶ 50 EC的平均值。对4只非糖尿病性白内障犬进行结膜活组织采样。选取非糖尿病非白内障犬中无眼部疾病的安乐病例进行结膜采样，作为对照组。

1.8 数据处理 应用统计软件SPSS 20.0对测定的连续变量进行平均数、标准差和组间方差分析，试验结果以平均数±标准差表示，对分类变量进行卡方检验，P<0.05具显著性差异。

2 结果

2.1 泪液测试 糖尿病性白内障犬的平均STT值为(16.3±4.5) mm/min右眼(Oculus dexter,OD)、(14.5±5.8) mm/min左眼(Oculus sinister,OS)；非糖尿病非白内障犬的平均STT值为(22.4±6.6) mm/min OD、(20.6±4.9) mm/min OS。糖尿病性白内障犬的STT值明显低于非糖尿病非白内障犬的STT值(P<0.05)。非糖尿病性白内障犬的STT值为(17.2±3.4) mm/min OD、(19.3±2.1)mm/min OS，与其他2个组无明显差异(P>0.05)。

2.2 泪糖浓度测试 糖尿病性白内障犬与非糖尿病犬的泪糖浓度未见明显差异(P>0.05)，非糖尿病非白内障犬和非糖尿病性白内障犬泪糖浓度无明显差异(P>0.05)。

2.3 犬角膜FL评分 角膜荧光素染色反映角膜受损的程度，本试验结果显示，糖尿病性白内障犬FL评分(4.2±2.6) s OD、(3.9±2.9) s OS，平均值明显高于非糖尿病非白内障犬(1.3±0.7) s OD、(2.2±0.9) s OS和非糖尿病性白内障犬(3.3±1.2) s OD、(4.2±1.5) s OS。

2.4 泪膜破裂试验 糖尿病性白内障犬TFBUTs平均值(7.2±3.8) s OD、(6.6±4.4) s OS，明显低于非糖尿病非白内障犬(19.0±5.2) s OD、(18.9±7.1) s OS和非糖尿病性白内障犬(15.4±7.6) s OD、(14.2±7.3) s OS。非糖尿病非白内障犬和非糖尿病性白内障犬的TFBUTs之间无明显差异(P>0.05)，每个组别中左、右眼无明显差异(P>0.05)。

2.5 结膜细胞学 对4只非糖尿病非白内障犬进行结膜细胞学采样，可见少量至中等数量的上皮细胞，包括鳞状细胞、柱状细胞、浅表上皮细胞，部分出现黑色素颗粒，而且非糖尿病非白内障犬结膜样本中都包含少量至中等程度的黏液。非糖尿病非白内障犬的30份结膜细胞学样本中的6份，均罕见中性粒细胞，仅1份样本发现结膜杯状细胞。糖尿病性白内障犬和非糖尿病性白内障犬的所有结膜样本中均可见少量至大量的上皮细胞(鳞状至柱状细胞)，4只糖尿病性白内障犬的6只眼睛和4只非糖尿病性白内障的8只眼睛的结膜细胞学样本，均可见少量中性粒细胞炎性浸润，大部分结膜细胞学涂片样本均有黏液，有6/30的糖尿病性白内障犬(9只眼睛)和4/30非糖尿病性白内障犬(6只眼睛)的结膜细胞学可见杯状细胞。

2.6 结膜病理学 对照组犬的结膜病理学检查可见GC∶50 EC为28∶50，可见基层至浅表均有上皮细胞的有序排列，于黏膜下层有少量单核细胞炎性浸润。糖尿病性白内障犬的结膜样本可见黏膜下层有少量至中量的单核细胞或中性粒细胞浸润，而非糖尿病性白内障犬结膜黏膜下层的单核细胞浸润情况与对照组类似，仅少量浸润。5/7的糖尿病性白内障犬结膜病理切片显示不同程度的结膜上皮细胞发育不良，其中部分伴有鳞状上皮化。7只糖尿病性白内障犬的平均GC∶50 EC值是20∶50，但是GC∶50 EC比值跨度范围较大，其中3只糖尿病性白内障犬的GC∶50 EC平均值为27∶50，而另外4只糖尿病性白内障犬的GC∶50 EC平均值为11.5∶50，表现杯状细胞中等至重度减少。非糖尿病性白内障犬的GC∶50 EC值(27∶50)与对照组非糖尿病非白内障犬的GC∶50 EC值(28∶50)很接近。糖尿病性白内障犬、非糖尿病性白内障和非糖尿病非白内障犬的GC∶50 EC平均值无明显差异(P>0.05)。

3 讨论

糖尿病对犬角膜结膜参数有很重要的影响作用，尤其是糖尿病性白内障犬，相对于非糖尿病非白内障犬，其泪膜成分已经发生改变。泪膜中的水溶液层减少，糖尿病性白内障犬的STT值明显低于非糖尿病非白内障犬，同理，在人医中胰岛素依赖型糖尿病患者的泪液量相对非糖尿病人降低了37%[6]。虽然本试验中，糖尿病性白内障犬的STT值仍然大于10 mm/min，当患犬经历过白内障手术后，其泪液中水溶液的减少更容易表现出临床症状。泪膜破裂试验可以作为评价泪膜质量的推断性指标，糖尿病性白内障犬的TFBUTs值明显低于非糖尿病性白内障犬和非糖尿病非白内障犬，本试验中非糖尿病非白内障组的平均TFBUTs(19.0 s OD、18.9 s OS)与前人研究报道的健康犬的TFBUTs值类似(19.7 s)[7]。在本试验中，糖尿病性白内障犬的细胞学和病理学结果都显示轻度至中等程度化脓性或淋巴浆细胞性结膜炎，同时显示TFBUTs(7.2 s OD、6.6 s OS)，临床表现仅有轻度至中等角膜结膜水肿，然而在非糖尿病性白内障犬和非糖尿病非白内障犬中没有结膜炎的表现。

结膜上皮GC∶50 EC值的采样部位是犬结膜囊，通过杯状细胞数量间接反映黏蛋白的产生量，在人医研究中有报道提出相对于黏蛋白数量，结膜杯状细胞数量对早期的眼表疾病更具有指示意义，可以通过结膜细胞刷或细胞学压片评估GC密度以及结膜的鳞状上皮化程度[8]。根据目前的研究方法，只有结膜组织病理学可以同时反映结膜上皮细胞形态以及GCs数量。由于结膜组织样本的采样需要征求糖尿病性白内障患犬或非糖尿病性白内障患犬主人的同意，所以没有办法对每1个试验患犬进行结膜样本的采集。有文献研究表明，糖尿病性白内障犬结膜组织病理学表现出不同程度的结膜上皮发育不良，同时可能伴有上皮鳞状化[9]。该试验结果与人医对糖尿病患者的研究结果相符，人医糖尿病性白内障患者临床表现可见明显的结膜表面疾病，包括鳞状上皮化等，其病因可能是因为反射性泪液减少，导致泪膜营养功能改变或结膜上皮细胞的代谢异常[9]，该假设与本试验中糖尿病性白内障犬的结膜化生病因类似。

小动物临床认为糖尿病性神经病变是公认的糖尿病患病动物的长期并发症，比糖尿病性视网膜病变或糖尿病性肾病更常见，然而直到近几年才将糖尿病患犬角膜敏感性降低列为糖尿病性神经病变的表现，且有不同的理论阐述角膜敏感度降低的发病机理[10]。糖尿病性神经病变理论主要包括多元醇代谢途径发生改变造成神经组织代谢失衡，血管系统发生变化造成神经水肿，最终造成神经传导受损[11]。糖尿病性白内障犬与非糖尿病性白内障犬和非糖尿病非白内障犬对比，其泪膜的数量和稳定性下降，易发干眼症。糖尿病性白内障犬的角膜结膜形态发生改变，常规荧光素染色可以作为早期诊断手段。综上所述，建议治疗方法包括补充局部人工泪液、局部使用泪液刺激剂和黏蛋白类似物，例如糖尿病患犬可增加环孢素眼药等。