牡丹籽蛋白提取工艺及其多肽应用研究进展

◎ 陈 容，胡素素，郑淳坚，柯德森

（广州大学 生命科学学院，广东 广州 510006）

牡 丹（Paeonia suffruticosaAndr.）为 芍 药 科、芍药属植物，为中国国花，其分为观赏型牡丹与油用型牡丹，油用牡丹在提油过程中籽粕的产出率为25%～30%，我国每年产生高达5万t的牡丹籽壳和饼粕[1]，大多被用作蛋白饲料或丢弃。牡丹籽粕含多种营养成分，粗蛋白含量高达28.12%，包含8种必需氨基酸，此外还含有黄酮、多糖等物质[2]。牡丹籽蛋白具有较好的起泡性、持水性、乳化性与乳化稳定性[3]，此外，牡丹籽多肽还具有抗氧化、抗菌、降血压、降血糖和免疫调节等生物活性，开发利用前景广阔。

本文概述了牡丹籽蛋白的制备方法及其多肽的功能特性，为牡丹籽蛋白的进一步开发利用提供参考，充分开发利用牡丹籽粕资源，提高牡丹种植的附加值。

1 牡丹籽蛋白提取工艺

1.1 反胶束萃取法

反胶束是表面活性剂溶于有机溶剂后自发形成的一种纳米聚集体，能够将具有亲水性的生物大分子溶解其中，以胶束的形式萃取出来[4-5]。目前较多研究者使用该方法分离油脂与蛋白质达到分离纯化蛋白质的目的，但将此方法用于提取牡丹籽蛋白的研究较不常见。

昝丽霞等[6]通过实验与响应面分析优化了反胶束萃取法在不同物理辅助法下的工艺条件，微波辅助法：时间10.20 min、微波温度47.66 ℃、微波功率400 W，此条件下牡丹籽蛋白萃取率为48.22%；超声辅助法：超声时间60 min、超声温度30 ℃、料液比1∶50，此条件下牡丹籽蛋白萃取率为84.33%，超声辅助萃取率高于微波辅助萃取。

反胶束萃取法的条件温和，具有萃取效率高、操作简单、蛋白质不易失活、溶剂可以循环利用及成本较低等优点。缺点是使用溶剂较多，表面活性剂可能存留于产品中，且不利于提取相对分子质量较大的蛋白质[7-8]。

1.2 碱溶酸沉法

碱溶酸沉法是牡丹蛋白目前较为普遍与传统的提取方法，其利用物料中不同组分具有的酸碱性差异将它们进行分离。调节溶液的pH值到蛋白的等电点时，蛋白就会沉淀，从而达到分离蛋白的目的[9]。徐玥等[10]通过实验优化碱提酸沉法提取牡丹籽蛋白的最佳工艺条件为料液比1∶12、碱液pH=8.5、提取时间60 min、提取温45 ℃，在此条件下牡丹籽蛋白提取率为（78.23±0.04）%；牡丹籽蛋白最佳酸沉条件为pH=4.0，此时蛋白沉淀率达（90.90±0.11）%。王敏等[11]发现采用碱溶酸沉法提取的牡丹籽蛋白在中性条件拥有比米糠蛋白更高的溶解度。

碱提酸沉法存在耗酸耗碱量较大、易造成环境污染、蛋白质变性及所提蛋白纯度不高等不足[12]。近年来由于超声波技术的发展与广泛应用，较多研究者开始尝试采用超声辅助碱提取方法来提取籽粕中的蛋白质。超声波所具有的机械粉碎和空化作用能够使溶剂以更大的速度渗透入原料细胞内[13]，单位时间内拥有更大的渗透率，从而缩短蛋白质提取时间，提高提取率。刘柏华等[12]发现相比于常规碱提取，用超声辅助碱提取法提取牡丹籽蛋白，提取率高出7.17%，纯度提高14.49%，碱液消耗减少1/3，各种氨基酸的含量也有一定提高，总含量达95.049 mg/100 g。王青等[14]通过超声波辅助碱提法提取牡丹籽蛋白，得出蛋白质提取率影响因素的影响程度依次是：溶液pH＞提取时间＞提取温度＞料液比。优化后的蛋白质提取工艺为提取温度47 ℃、料液比1︰35 g·mL-1、提取时间150 min、pH=11.5，所得蛋白质提取率为93.12%。

除超声波辅助等物理辅助法外，庞雪风等[15]还尝试采用了糖化酶辅助碱溶酸沉法提取了牡丹籽蛋白，提取率为88.34%。

1.3 盐溶法

低盐浓度条件下，蛋白质结构中的疏水部位或基团在水中形成水膜，阻碍分子间相互接触。中性盐加入后与蛋白质争夺水分子、破坏水膜，使蛋白质分子在疏水键作用下聚沉。NaCl溶液能使蛋白质保持自身特性与功能，避免变性[9]。碱溶法的提取率高于盐溶法，但盐溶法提取的蛋白具有更佳的色泽[16]。

李强等[17]优化得到盐溶法最佳提取工艺为：提取时间69 min，提取温度为40 ℃，料液比为1︰20，NaCl浓度为1.03 mol·L-1，蛋白提取率为23.49%，蛋白有效提取出78.30%。

1.4 酶解法

酶解法提取是利用酶的专一性，与牡丹籽粕的特定物质相互作用得出多肽。其分为蛋白酶法与非蛋白酶法，常用的蛋白酶有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶等，其中碱性蛋白酶的酶解效果最好。非蛋白酶法是将牡丹籽粕中的纤维素、淀粉等非蛋白质成分水解，使蛋白质的提取及其与蛋白酶的相互作用更加容易[18]。

乔慧茹等[19]用6种蛋白酶对牡丹籽粕进行水解，其中采用复合酶与碱性蛋白酶可获得较高的多肽得率，且碱性蛋白酶酶解多肽具有较强的综合抗氧化能力，在吸油性和乳化性方面也表现更佳。实验表明碱性蛋白酶的最佳酶解条件为：加酶量36 000 U·g-1，提取温度55 ℃，提取时间2 h，pH为11，料液比1∶40 g·mL-1。王颖颖等[20]研究表明中性蛋白酶只能有限地水解牡丹籽蛋白，而碱性蛋白酶仅1 h即可完全水解牡丹籽蛋白所有的条带，产生一系列小于15 kDa的小分子量条带。碱性蛋白酶还能显著性地提高蛋白的ABTS和·OH自由基清除活性，在酶解4 h时，两种自由基的清除率分别达到51.22%和73.66%。研究表明[21]酶解产物的抗氧化性与水解度之间非简单的线性关系，即抗氧化能力并非随着水解度的升高而增大。

除了采用单酶进行酶解，也有研究采用多种不同的酶同时或分步水解蛋白，以提高多肽得率。王封等[22]首先利用纤维素酶解除籽粕中的纤维素对蛋白质的束缚，而后通过混合酶组合——Alcalase酶与木瓜蛋白酶对牡丹籽蛋白进行酶解，多肽收率达60%，耗时不超过20 h。

酶解法具有提取率高、选择性强、反应条件温和、能耗低等特点，对营养成分的破坏性小，一般不存在毒理问题。但酶解制备生物活性肽的过程普遍会产生苦味肽，若应用于食品领域，则需要通过吸附剂或外切酶等方式改善口感[23-24]。

1.5 发酵法

发酵法通过微生物发酵过程产生的复合酶系降解底物，能够得到水解度较高的产物，无需进行酶的制备与纯化。相对于其他方法具有成本较低、产量高、无污染、营养损失少等特点。并且微生物产生的肽酶能够去除苦味肽，多用于食品生产领域，目前可用于食品开发的菌种数量有限，在选用菌种时需考虑安全问题[24-25]。

赵修华等[26]通过碱溶酸沉提取出牡丹籽蛋白后，分别接入几种菌种进行发酵，其中经过纳豆芽孢杆菌发酵后所得的多肽具有最高的氨基酸含量，为12.36%，且含有大于15种常见氨基酸，多肽水溶性好（溶解度为50 mg·mL-1）。郭鹏等[27]采用由凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌所组成的混合菌以菌液的形式加入脱脂牡丹籽中，通过发酵提取蛋白质，再利用蛋白酶酶解制取多肽，多肽得率在42.5%～51.5%，未经发酵实验组的多肽得率为34.8%，低于发酵实验组，原因是牡丹籽中的木质纤维被降解为多糖小分子，减少了其对于蛋白质的束缚，蛋白酶因此能够与蛋白质充分接触，提高酶解效果。

2 牡丹籽多肽的功能活性

生物活性肽是一类具备抗氧化、抑菌、降血压、血糖等能力的小分子活性物质。目前国内外许多研究表明牡丹籽粕多肽作为优质的植物蛋白源肽，同样具有高抗氧化能力、抗菌抑菌能力、免疫活性以及降血压、血糖等能力。

2.1 抗氧化作用

小分子活性肽作为蛋白质主要水解产物，通常具有较好的还原力，清除自由基、螯合金属离子、抑制活性氧生成等抗氧化活性，能够有效延缓机体衰老。

研究发现，牡丹籽多肽的综合抗氧化能力与谷胱甘肽相近或更优[28]。数据显示，酶解产生的多肽分子的抗氧化活性高低与3个因素息息相关，分别是分子量、氨基酸组成及序列、所带电荷[29]。王敏等[30]通过实验表明分子量在1 kDa以下的牡丹籽多肽具有明显的清除自由基优势，其抗氧化活性受分子量与浓度影响。其中多肽浓度与抗氧化活性之间呈现出明显的剂量相关性，对5种多肽分子的体内抗氧化能力进行深入研究，结果显示其抗氧化活性与体外自由基清除实验相近。根据氨基酸分析结果，可得牡丹籽多肽的水解氨基酸中Glu和Asp两种含量最高[21]。Glu和Asp可与自由基有效结合，抑制自由基链式反应，从而清除自由基，显示出高抗氧化性[31]。

2.2 抗菌抑菌作用

目前，抗生素的滥用已造成更多耐药菌的产生，而抗菌肽由于具备抗生素替代品的优势而应用前景广阔[32]。以牡丹籽蛋白质水解制得的多肽，显示出良好的抗菌杀菌功效。

胡勇杰等[33]以牡丹肽作为原料制备出一种新型整理剂，当其浓度达到30 g·L-1时，抗菌功效显著，对4种细菌达到90%以上的抑菌率，其中包括常见的金黄色葡萄球菌以及肺炎杆菌。

2.3 免疫调节作用

牡丹籽多肽在被消化或水解后显示出免疫活性[34]，能增强非特异性、体液和细胞免疫反应[35]。

杜珍奇[36]利用酶解法获得6种蛋白酶解产物，并研究它们对于正常小鼠免疫活性的调节作用，通过动物体实验，观察小鼠免疫器官指数和迟发型超敏反应，结果表明牡丹籽蛋白酶解产物免疫效果较好，能够对正常小鼠相关免疫器官的发育起到促进作用，实现小鼠免疫力整体提升。乔慧茹等[19]同样采用动物体实验，以小鼠免疫器官作为指标，反映它们的免疫能力强弱，证明了牡丹籽多肽能提高小鼠的免疫器官指数。同时，牡丹籽粕多肽免疫调节能力呈现一定的剂量相关性，高剂量相较于中、低剂量的多肽免疫调节功效更强。

2.4 降血压作用

血管紧张素酶（ACE）可发挥其催化作用并经过人体内一系列反应使血管收缩最后导致血压升高，而ACE抑制肽作为前者的抑制剂可以起到抑制酶活的作用，从而对人体血压进行调控。根据牡丹籽多肽的氨基酸分析结果[21]，其所含氨基酸中以Phe、Pro和Tyr居多，而研究表明[37]当多肽C端3个氨基酸包括Phe、Pro、Trp和Tyr时，ACE抑制率会显著提高。进一步研究发现[38]，在ACE抑制肽中含有的芳香性氨基酸及疏水氨基酸都能够提高其抑制活性，而牡丹籽蛋白中疏水性氨基酸占比为20.87%[28]，牡丹籽多肽中则高达50%～75%，实验制得的5种多肽全部包含芳香族氨基酸[30]。由此可知，在牡丹籽多肽的结构上，表现出了其作为ACE抑制肽优质来源的潜能。陈秋銮等[38]采用中性蛋白酶酶解牡丹籽蛋白制备ACE抑制肽，得到其在最佳工艺条件下的抑制率可达到（86.93±2.38）%。中性水解酶主要酶切位点为Phe-、Trp-和Tyr-，且能够在多肽的C末端进行特异性酶切产生芳香族氨基酸或疏水性氨基酸，故能够得到ACE抑制活性较高的多肽[39]。

2.5 降血糖作用

牡丹籽粕多肽属于小分子活性肽，能够在人体内发挥更高的活性且毒副作用更低。有研究表明，抑制α-葡萄糖苷酶活性能够有效抑制葡萄糖吸收进而有助于控制糖尿病。颜辉等[40]以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标得牡丹籽多肽的实际抑制率为22.21%。有研究者发明出一种油用牡丹籽粕源的降血糖多肽，实验证明该降血糖多肽主要活性成分的氨基酸序列为Tyr-Phe-Phe-Met（YFFM）[41]。通过对6种不同的酶解牡丹籽粕多肽抑制活性研究可知，碱性蛋白酶水解产物的活性最高，且其抑制能力随多肽浓度的升高而提高[19]。

3 结语

随着人们对功能性健康食品与化妆品的需求不断增加，生物活性多肽类化合物由于具有高生物活性、安全无毒、无刺激性、易吸收等优势而备受关注。牡丹籽粕作为一种优质植物蛋白资源，绝大多数只是被用作蛋白饲料，经济效益低。牡丹从古代以来就一直作为中药发展至今，其药用价值被认为在牡丹根（丹皮）中最大，且多数研究集中于黄酮、多酚化合物等成分的功效上，对牡丹籽中多肽的研究极少，可能与提取技术的局限及蛋白质的不稳定性有关。

近年来，使用不同方法提取牡丹籽蛋白的研究逐渐增多，以碱溶酸沉与酶解法为主。将化学法与物理法或酶法相结合能够提高提取效果，今后可使用复合提取的方法探索最佳提取工艺。目前牡丹籽蛋白提取率与纯度不高的原因可能与原料特性有关，为制备纯度更高的牡丹籽蛋白及加大其应用范围，可进一步研究其功能特性。筛选稳定性较高的功能性多肽，同时寻找合适的稳定剂，实现低价值资源向高价值资源的转化，充分发挥其作为天然植物蛋白资源的作用。