产虾青素红法夫酵母的发酵工艺优化

江文涛，彭立影，马加军，张 超，赵春花

（广州金水动物保健品有限公司，广州 510545）

虾青素（Astaxanthin，3, 3’-二羟基-4, 4’-二酮-β,β’-胡萝卜素）是一种具有抗氧化、抗癌、增强免疫力等功能的类胡萝卜素[1]，在食品、养殖行业及化妆品、医疗保健领域都有广泛的应用[2]。目前，虾青素主要采用化学合成法、动植物提取法和微生物发酵法生产，生物源虾青素具有利用率高、活性高等优点[3]。

红法夫酵母发酵法生产虾青素具有生长速度快、发酵周期短等优点，但也存在虾青素代谢产量低的缺陷[4-7]，国内有较多科研人员致力于提高红法夫酵母菌虾青素产量的研究，一般通过优化培养基的配方、诱变选育高产菌株等方式提高虾青素的产量。本试验以红法夫酵母菌Yea.pr-17为研究对象，以常规的酵母发酵培养基作为对照，优化出更适宜红法夫酵母产虾青素的培养基及培养条件，以期提高虾青素产量，为虾青素规模化生产提供依据。

1 材料

1.1 菌株

红法夫酵母Yea.Pr-17，自主筛选保存。

1.2 培养基

种子活化培养基：采用YM培养基，500 mL三角瓶中装入YM培养基100 mL，115 ℃灭菌30 min，备用。

基础发酵培养基：采用YM培养基，500 mL三角瓶中装入YM培养基100 mL，115 ℃灭菌30 min，备用。

固体划线培养基：采用YM固体培养基，琼脂量为1.6%。

1.3 仪器

紫外可见光光度计（型号为752G），上海奇立科学仪器有限公司产品；微量台式高速离心机（型号为TG16-W），湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；数显恒温水浴锅（型号为HH-4），常州澳华仪器有限公司产品；pH计（型号为PHS-3C），上海悦丰仪器仪表有限公司产品。

2 方 法

2.1 培养

2.1.1 种子培养

取红法夫酵母菌种划线于固体划线培养基，置于（20±1）℃培养箱恒温培养2 d。挑取活化的单菌落2～3 环接种于装有100 mL 种子活化培养基的500 mL三角瓶中，（20±1）℃、180 r·min-1培养2 d。

2.1.2 发酵培养

将活化好的菌种按照5.0%的接种量接种到发酵培养基中，于（20±1）℃摇床200 r·min-1振荡培养6 d，测定虾青素产量。

2.2 指标测定

菌液浓度测定采用紫外可见光分光光度法；pH值用PHS-3C型pH计测定；虾青素含量按照《饲料添加剂10%虾青素》（GB/T 23745—2009）中的方法进行测定；残糖采用DNS法测定。

2.3 试验内容

2.3.1 培养基的选择

根据酵母菌的营养特性设计14 组培养基，见表1，将活化好的菌种按照5.0%的接种量接种到发酵培养基中，于（20±1）℃摇床180 r·min-1振荡培养6 d，测定虾青素产量。

表1 培养基配方

2.3.2 接种量对红法夫酵母发酵产虾青素的影响

以优选的发酵培养基为基础，按1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%接种量接种红法夫酵母，于（20±1）℃摇床180 r·min-1振荡培养6 d，测定其菌液OD660值和虾青素含量。

2.3.3 发酵时间对红法夫酵母发酵产虾青素的影响

以优选的发酵培养基为基础，于（20±1）℃摇床180 r·min-1振荡培养 7 d，测定其菌液 OD660值和虾青素含量。

2.3.4 补充不同碳源对红法夫酵母发酵产虾青素的影响

以优选的发酵培养基为基础，在48 h 时分别补料10.0 g·L-1的葡萄糖、蔗糖和乳糖，（20±1）℃摇床180 r·min-1振荡培养，测定其菌液OD660值和虾青素含量。

2.3.5 补充不同氮源对红法夫酵母发酵产虾青素的影响

以优选的发酵培养基为基础，在48 h 时分别补料1.0 g·L-1的蛋白胨、酵母浸粉和硫酸铵，于（20±1）℃摇床180 r·min-1振荡培养，测定其菌液OD660值和虾青素含量。

2.3.6 不同促进剂对红法夫酵母发酵产虾青素的影响

以优选的发酵培养基为基础，在48 h 时分别添加5.0 g·L-1的番茄红、淀粉及碳酸钙等促进剂，于（20±1）℃摇床180 r·min-1振荡培养，测定其菌液OD660值和虾青素含量。

2.3.7 补料方式对红法夫酵母发酵产虾青素的影响

以优选的发酵培养基为基础，设定4种葡萄糖补料方式，A 组：培养 24 h、38 h、48 h、62 h 分别流加500 g·L-1葡萄糖3 mL、2 mL、2 mL、2 mL；B组：培养24 h、38 h、48 h、62 h分别流加500 g·L-1葡萄糖2 mL、2 mL、2 mL、2 mL；C组：培养24 h、38 h、48 h、62 h 分别流加500 g·L-1葡萄糖 1 mL、1 mL、2 mL、2 mL；以未添加葡萄糖为空白组。按4%接种量接种红法夫酵母，于（20±1）℃摇床180 r·min-1n振荡培养，于24 h、48 h、60 h、84 h、108 h、132 h、204 h、240 h 测定其菌液OD660值和虾青素含量。

3 结果与分析

3.1 培养基的选择

14 种不同培养基对红法夫酵母产虾青素的影响结果见图1。

由图1可知，培养基2、3和7组虾青素产量均高于42.0 mg·L-1。其中培养基3配方成本低，且虾青素产量最高。因此，选择培养基3为基础培养基进行下一步优化试验。

图1 不同培养基对红法夫酵母虾青素产量的影响

3.2 接种量对红法夫酵母发酵的影响

接种量对红法夫酵母生长及虾青素产量的影响结果见图2和图3。

图2 接种量对红法夫酵母生长的影响

图3 接种量对虾青素产量的影响

由图2 可知，发酵前3 d 红法夫酵母生物量皆显著增加，菌体大量增殖，3～4 d 趋于稳定，菌株繁殖速率减缓。由图3 可知，前2 d 虾青素产量较少，3～5 d虾青素大量累积。最终接种量为4.0%时虾青素产量最大达48.85 mg·L-1。

3.3 发酵时间对红法夫酵母发酵的影响

发酵时间对红法夫酵母生长及虾青素产量的影响结果见图4。

图4 发酵时间对红法夫酵母生长及虾青素产量的影响

由图4 可知，发酵前期0～2 d 时菌体迅速增加，第3 天后菌体不再明显增长；还原糖在第2 天时降低至3.0 g·L-1，在第3 天时基本被利用完。虾青素含量随着发酵的时间延长随之增加。在第2天时虾青素迅速增加，3～6 d 处于累积时间，第6 天时虾青素含量趋于稳定。

3.4 补充不同碳源对红法夫酵母发酵的影响

补充不同碳源对红法夫酵母生长及虾青素产量的影响结果见图5和图6。

图5 补充碳源对红法夫酵母生长的影响

由图5 和图6 可知，在发酵48 h 时，补充10.0 g·L-1的葡萄糖、蔗糖及乳糖，对红法夫酵母生长及产虾青素具有不同的影响。48 h前，三组红法夫酵母的生物量急剧增加；60 h后进入稳定期。葡萄糖组红法夫酵母生物量较高，生长较好；乳糖组较差。132 h 时，葡萄糖组别红法夫酵母虾青素产量高于蔗糖组及乳糖组12%；132 h 后，三组虾青素产量差异不明显。从菌体的生长及虾青素的产量考虑，补料时以葡萄糖为碳源，可促进红法夫酵母的生长及虾青素的合成。

图6 补充碳源对红法夫酵母虾青素产量的影响

3.5 补充不同氮源对红法夫酵母发酵的影响

由补充不同氮源对红法夫酵母生长及虾青素产量的影响结果见图7和图8。

图7 补充氮源对红法夫酵母生长的影响

图8 补充氮源对红法夫酵母虾青素产量的影响

由图7和图8可知，在发酵48 h后添加1.0 g·L-1的酵母粉、蛋白胨及硫酸铵，对红法夫酵母生物量及虾青素的合成影响显著。酵母粉及蛋白胨皆为有机氮源，更有利于细胞的生长及虾青素的合成。84～132 h时，蛋白胨组虾青素含量高于酵母粉及硫酸铵组；204 h 时，相比蛋白胨组和硫酸铵组，酵母粉组红法夫酵母的虾青素产量提高39%～65%。

3.6 不同促进剂对红法夫酵母发酵的影响

不同促进剂对红法夫酵母生长及虾青素产量影响结果见图9和图10。

图10 不同促进剂对红法夫酵母虾青素产量的影响

由图9 和图10 可知，淀粉和番茄红的添加对红法夫酵母的生长没有促进作用，碳酸钙的添加对红法夫酵母的生长具有促进作用。发酵132 h前，碳酸钙的添加可显著提高红法夫酵母虾青素产量，发酵204 h 时，其虾青素含量与空白组接近。钙离子能够激活丙酮酸脱氢酶，且钙离子可促使细胞线粒体内ATP 的合成，为微生物的生长提供能量，从而促进代谢产物的积累。可见，碳酸钙的添加可加快虾青素的合成。发酵204 h 时，淀粉及番茄红组虾青素产量显著高于其他组别，与空白组对比分别提高了35%、20%。考虑淀粉在发酵后期可刺激红法夫酵母产虾青素，而番茄红是虾青素合成的前体物质，添加番茄红可在发酵后期促进虾青素的合成。可考虑通过补料加入前体物质，既能满足产物合成的需要，又可避免前体物质大量积累抑制菌体的生长，从而提高虾青素的合成。

3.7 补料方式对红法夫酵母发酵的影响

补料方式对红法夫酵母生长及虾青素产量影响结果见图11和图12。

图11 葡萄糖补料方式对红法夫酵母生长的影响

图12 葡萄糖补料方式对红法夫酵母虾青素产量的影响

由图11 和图12 可知，随着葡萄糖补料量的增加，酵母的生物量及虾青素的含量在继续增加；发酵132 h后，空白组虾青素含量趋于稳定，而补充葡萄糖的组别虾青素含量还在显著增加；204 h时A 组虾青素含量可达到112 mg·L-1，比空白组高出120%。可见，葡萄糖的间歇流加对红法夫酵生长及虾青素的合成具有促进作用。

4 结 论

以红法夫酵母Yea.Pr-17为研究对象，通过优选基础发酵培养基，最终确定了葡萄糖30.0 g·L-1，酵母浸粉5.0 g·L-1，磷酸二氢钾3.0 g·L-1，硫酸镁3.0 g·L-1，磷酸氢二钠 1.0 g·L-1为基础发酵培养基。在发酵48 h 时，添加10.0 g·L-1葡萄糖碳源、1.0 g·L-1酵母粉氮源、5.0 g·L-1番茄红及5.0 g·L-1淀粉对红法夫酵母产虾青素具有促进作用。在无外加营养物质的条件下，发酵6 d、接种量为4%可获得较高的虾青素产量。葡萄糖的间歇流加对红法夫酵生长及虾青素的合成具有促进作用，比空白组提高了120%。

5 讨 论

试验过程设计有许多考虑不全面的因素，如在培养基优化方面考虑问题不够全面，后续还可在氮源、生长因子、培养条件等因素上综合考虑，进一步优化出更加适宜红法夫酵母菌Yea.Pr-17生长的培养基以及培养条件，在此基础上，菌株所产的虾青素还有希望得到进一步的增加。其次，在虾青素的提取方法以及新产品开发和应用上仍有较大的研究空间，后续试验研究可以从以上方面进行。