发酵棉籽粕膳食纤维制备的工艺参数优化

杨梦琪，南珊珊，王海亮，牛俊丽，张文举，聂存喜

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003）

膳食纤维作为第七大营养素具有突出的保健功能，在人类生活中广泛应用。摄入一定含量的膳食纤维可以有效缓解便秘[1]、降低癌症风险[2]、降低胆固醇[3-4]、预防糖尿病[5]、调节脂肪代谢[6-8]、改善肥胖[9]、调控肠道健康[10-11]。因此，在动物生产中也可能有巨大的应用价值。膳食纤维的生理功能与其理化性质有关。其中，持水性是影响葡萄糖扩散的关键因素[12]，对防治糖尿病有重要作用。不同的膳食纤维化学组成、结构和加工条件等均会影响其持水性、膨胀性等理化特性，而理化特性可以通过影响消化道内容物重量，进而影响动物摄食量，缩短肠道转运时间（如纤维素、麦麸和木质素）[13-14]，这可能使动物生长性能等发生改变。有调查表明[15]，膳食纤维主要通过增加日粮持水力和黏度，增强母猪的饱腹感，调节母猪肠道微生物菌群，保持母猪肠道结构完整性。可见，膳食纤维的组成及其理化性质能影响动物肠道健康，进而影响其生长发育。膳食纤维根据其溶解性分为不可溶性膳食纤维和可溶性膳食纤维，其中可溶性膳食纤维更容易被肠道消化吸收。研究表明，发酵法能有效提高饲料中的蛋白质含量[16]，而微生物发酵产生的纤维素酶和半纤维素酶[17]能有效降解植物中的多糖，菌株Neurospora crassa SD10[18]发酵麸皮产生的木聚糖酶能水解非淀粉多糖中的β-1,4糖苷键，从而提高纤维素的利用率。而利用发酵棉籽粕制备膳食纤维的研究较少。而棉花作为新疆的优势资源，利用棉籽粕制备膳食纤维可以使其被有效利用，且棉籽粕经过发酵后有毒棉酚含量降低，其中的功能活性物质含量增加[19]，本试验以发酵棉籽粕为原料制备膳食纤维，并对其进行工艺优化，确定最佳提取工艺。为进一步评定日粮添加发酵棉籽粕膳食纤维对畜禽生长性能、肠道发育等提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棉籽粕、玉米、麸皮，均购自新疆泰昆饲料科技有限公司；热带假丝酵母ZD-3（Candida tropicalis ZD-3），由石河子大学动物营养实验室提供；YPD 培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；α-淀粉酶（酶活为50 U·mL-1），购自上海源叶生物科技有限公司，酶活力定义为：在温度25 ℃、pH值6.9条件下，1 min内液化1 mg可溶性淀粉所需要的酶量，即为1 个酶活力单位）；中性蛋白酶（酶活：100 U·mg-1，购自上海源叶生物科技有限公司，酶活力定义为：1 g 固体酶粉（或1 mL 液体酶），在40 ℃、pH 值7.5条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位）；植物油、氢氧化钠、盐酸、75%乙醇、95%乙醇、丙酮，均为市售。

1.2 试验仪器与设备

电热鼓风干燥箱（型号为GZX-9070MBE），上海博迅医疗生物仪器股份有限公司产品；粉碎机（型号为FZ102），上海楚定分析仪器有限公司产品；电子天平（型号为BS224），上海精密仪器仪表有限公司产品；高压灭菌锅（型号为MLS3750），上海赛默生物科技发展有限公司产品；超净工作台（型号为SWCJ-22），上海沪净医疗器械有限公司产品；数显电热培养箱（型号为HPX-9162MBE），上海博迅医疗生物仪器股份有限公司产品；旋转蒸发仪（型号为RE-52），上海亚荣生化仪器厂产品；水浴锅（型号为HH-1），常州朗越仪器制造有限公司产品；pH 检测计（型号为PH818），广东深圳市吉格机电设备有限公司产品。

1.3 试验设计

本试验首先采用单因素试验设计，再根据单因素试验得到的结果，用四因素三水平正交试验进一步优化酶解条件。以可溶性膳食纤维（SDF）提取率作为确定最优工艺条件的依据。提取率最高的组合即为发酵棉籽粕膳食纤维提取的最佳工艺组合。

1.4 发酵棉籽粕的制备

发酵底物按照棉籽粕∶玉米∶麸皮=90∶5∶5 的比例混合均匀，底物与水的比例为1∶0.4。发酵棉籽粕制备的具体过程参考魏莲清等[20]的方法。

1.5 可溶性膳食纤维制备的工艺流程

取500 g 发酵棉籽粕，加入一定量0.6 mol·L-1的NaOH 溶液浸提3 h 取沉淀。沉淀经清洗烘干粉碎。取一定量碱处理后的发酵棉籽粕沉淀，加入纯化水。混匀后加入一定量α-淀粉酶，一定条件下进行酶解，95 ℃水浴加热10 min 灭酶。冷却至室温后，加入中性蛋白酶，继续在相同条件下酶解。将酶解后的样品溶液冷却至室温，在8 000 r·min-1条件下离心10 min得到上清液和沉淀。上清液用4倍体积95%乙醇醇沉10 h、抽滤/离心，之后用75%乙醇和丙酮洗涤3次，烘干，最终得到SDF。

1.6 单因素试验

经过预试验，选取影响可溶性膳食纤维提取率的主要因素：复合酶含量、料液比、酶解温度/℃、酶解时间/h，进行单因素试验的条件优化。各因素变化阈值见表1。

表1 单因素试验各因素变化阈值

以SDF提取率为指标进行筛选，计算公式如下：

1.6.1 复合酶含量变化的单因素试验

在料液比为1∶10、酶解温度为45 ℃、酶解时间为2 h 的条件下，考察复合酶（α-淀粉酶和中性蛋白酶）含量为0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%时对SDF提取率的影响。

1.6.2 料液比变化的单因素试验

在复合酶（α-淀粉酶和中性蛋白酶）含量为0.6%、酶解温度为45 ℃、酶解时间为2 h 的条件下，考察料液比为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40时对SDF提取率的影响。

1.6.3 酶解温度变化的单因素试验

在复合酶（α-淀粉酶和中性蛋白酶）含量为0.6%、料液比为1∶10，酶解时间为2 h 的条件下，考察酶解温度为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃时对SDF提取率的影响。

1.6.4 酶解时间变化的单因素试验

在复合酶（α-淀粉酶和中性蛋白酶）含量为0.6%、料液比为1∶10，酶解温度为45 ℃的条件下，考察酶解时间为0.5 h、10 h、1.5 h、2 h、2.5 h时对SDF提取率的影响。

1.7 正交试验

在单因素试验结果的基础上，选取上述4个因素的适宜条件范围，以SDF提取率为评价指标进行四因素三水平的正交试验优化，其中酶解温度为 40～50 ℃、料液比为1∶5～1∶15、酶解时间1.5～2.5 h、复合酶含量为0.5%～0.7%。试验因素水平设计见表2。

表2 正交试验因素和水平设计

1.8 统计分析

试验结果用Excel 软件进行初步统计，数据重复3 次取平均值，用SPSS 20.0 软件进行单因素方差（ANOVA）分析求得标准差。使用Origin Pro 9.1 进行绘图，数据采用“平均值±标准差”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 不同工艺参数对SDF提取率的影响

2.1.1 复合酶含量对SDF提取率的影响

复合酶含量是影响SDF 提取率的主要因素。见图1，当复合酶含量为0.5%时，随着酶含量增加SDF 提取率提高，在0.6%时达到峰值，SDF 提取率为26.13%。随着复合酶含量继续增加，SDF 提取率降低。当复合酶含量为0.8%时，SDF 含量降低了约4%，随后呈缓慢降低趋势，说明在0.6%的酶添加量之后，复合酶含量增加并不能无限提高SDF 提取率，可以判断0.6%为复合酶最佳添加含量。

图1 复合酶含量对SDF提取率的影响

2.1.2 料液比对SDF提取率的影响

料液比对SDF提取率影响也较大，提取率的最大值和最小值相差在6%左右。见图2，当料液比小于1∶10 时，发酵棉籽粕SDF 提取率与料液比呈正相关，而料液比大于1∶10，SDF提取率呈下降趋势。其原因可能与酶作用程度相关，当底物浓度低于一定程度时，酶解速率下降。在其他因素不变的前提下，料液比为1∶10 时，SDF 提取率最高，为16.91%。

图2 料液比对SDF提取率的影响

2.1.3 酶解温度对SDF提取率的影响

从图3中可以看出酶解温度显著影响SDF提取率。在45～50 ℃范围内SDF提取率变化不大，其中在45 ℃时SDF 提取率最高。之后随着温度升高到60 ℃时，SDF 提取率降至19.64%。因此最佳反应温度为45 ℃，SDF提取率达25.73%。

图3 酶解温度对SDF提取率的影响

2.1.4 酶解时间对SDF提取率的影响

从图4中可以看出，酶解时间对SDF提取率影响较大。反应时间为0.5 h的提取率最低，到2 h时呈上升趋势，其中SDF 提取率相差10%。2 h 后SDF 提取率呈下降趋势。在反应时间为2 h 时，SDF提取率最高，为21.36%。

图4 酶解时间对SDF提取率的影响

2.2 正交试验结果

在单因素试验基础上，设定了四因素三水平正交试验，采用正交表L9（34），正交试验极差及方差分析结果见表3。

由表3 中可以看出B 因素（料液比）的R值最大，为2.10，说明料液比单因素对SDF提取率影响最大，其次分别是酶解温度（A）、酶解时间（C）、复合酶含量（D）。该结果与单因素试验结果基本符合。最后得出四个因素对试验的结果影响的主次顺序为：B＞A＞C＞D，即料液比＞酶解温度＞酶解时间＞复合酶含量。通过直观分析法，按照各因素最优水平，最优组合为A2B2C3D1，即最佳工艺条件是：酶解温度45 ℃，料液比1∶10，酶解时间2.5 h，复合酶含量0.5%，其SDF 提取率为26.53%，说明其优化条件可靠。

表3 正交试验结果

3 讨 论

3.1 不同工艺参数对SDF提取率的影响

3.1.1 复合酶含量对SDF提取率的影响

当复合酶含量为0.5%时，随着复合酶含量增加SDF提取率提高，在0.6%时达到峰值，SDF提取率为26.13%。随着复合酶含量继续增加，SDF 提取率降低。说明在6%酶添加量之后，复合酶含量增加并不能无限提高SDF提取率，这可能与酶的竞争性抑制和酶与底物比例有关[21]。当酶含量小于0.6%时，反应体系酶浓度不足，水解程度不完全，但随着复合酶含量增加，淀粉酶和蛋白酶将大分子物质水解成单糖、多肽等小分子物质，当酶浓度过高时，膳食纤维结构如α-糖苷键破坏，淀粉长链断裂，反应平衡被打破，导致提取率降低[22]。因此，酶用量达原料的0.6%时，即可达到理想的提取效果。

3.1.2 料液比对SDF提取率的影响

当料液比小于1∶10 时，发酵棉籽粕SDF 提取率与料液比呈正相关，而料液比大于1∶10时，SDF的提取率呈下降趋势。这与酶和底物的作用程度相关，当底物浓度低于一定程度时，酶解速率下降。李琦等[23]在提取韭菜根不溶性膳食纤维（IDF）时发现，当IDF在碱液中扩散达到平衡后，得率不再上升，随液料比继续增加，反而可能破坏溶出的IDF结构。王永刚等[24]在提取红枣膳食纤维（IDF）的单因素试验中，当料液比为1∶9 时酶与底物充分结合，得到最大提取率为8.42%。在本试验中，在其他因素不变的前提下，料液比为1∶10 时，SDF 提取率最高，为16.91%。

3.1.3 酶解温度对SDF提取率的影响

从图3 中可以看出，在45～50 ℃范围内，SDF提取率变化不大，其中在45 ℃时SDF 提取率最大。之后随着温度的升高SDF提取率逐渐降低。说明温度影响酶的稳定性，且45 ℃之后，酶活性降低，其原因可能与蛋白质变性有关。李黎等[25]在提取枣渣膳食纤维的研究中，当酶解温度为60 ℃时枣渣IDF得率最大，随后下降。可能的原因是随着温度到一定范围内，蛋白分子运动剧烈，破坏了酶的二级和三级结构键使酶失活。因此高温水解使SDF得率下降，所以最佳反应温度为45 ℃，SDF提取率达25.73%。

3.1.4 酶解时间对SDF提取率的影响

从图4中可以看出，酶解时间对SDF提取率影响较大。当反应时间为0.5 h时提取率最低，到2 h时一直呈上升趋势，其中SDF提取率相差10%。2 h后SDF 提取率呈下降趋势。在反应时间为2 h 时，SDF提取率最高，为21.36%。陈嫣等[26]在提取香芋皮SDF过程中采用微波辅助法，反应时间在12 min时提取率最高，随后趋于平稳，可能由于香芋皮中SDF 含量有限。在本试验中，酶解2 h 后提取率开始下降，可能是由于底物含量达到上限，继续酶解使产物结构发生变化，导致醇沉后的沉淀变少。

3.2 正交试验优化对SDF提取率的影响

单因素试验结果表明，当酶含量为0.6%、料液比为1∶10、酶解温度为45 ℃、酶解时间2 h 时，发酵棉籽粕中提取的SDF含量最高。而正交试验表明：酶解温度为45 ℃、料液比为1∶10、酶解时间为2.5 h、复合酶含量0.5%为最佳组合，提取率达26.53%，比单因素试验中最高提取率多0.4%。刘学成[27]采用超声波辅助酶法提取金针菇膳食纤维（DF），各因素对DF得率的影响大小依次为即超声波功率＞蛋白酶用量＞液料比＞α-淀粉酶用量。慈竹竹叶膳食纤维[28]提取的最优工艺为NaOH 溶液质量体积分数10%，提取时间为17 h，温度为42 ℃，料液比为1∶15，提取率为34.58%。

4 结 论

本试验条件下，发酵棉籽粕可溶性膳食纤维的最佳提取工艺参数为：酶解温度45 ℃、料液比1∶10、酶解时间2.5 h、复合酶含量0.5%，SDF 含量为26.53%。