丝裂原活化蛋白激酶MAP2K5-rs4776970多态性与异常代谢相关性研究

徐 旭, 刘金玲, 梁国威

(航天中心医院检验科，北京 100049)

近年来，我国人民生活水平有很大幅度的提高，但肥胖、高血压、血脂紊乱及糖代谢异常等疾病发生率也逐年的增高，并且多种异常的临床代谢症状同时出现称为代谢综合征(Metabolic syndrome,MS)，可引起血管动脉粥样硬化形成斑块，进而导致心梗、脑梗及糖尿病。近期发生的影响全球的新型冠状病毒，对人类的健康和生存存在严重威胁。有研究显示，新冠重症患者体型偏胖，合并症中存在高血压、糖尿病是发展成重型、危重型的高危因素之一。遗传因素对肥胖及其相关并发症的影响是近年来研究的热点之一，其最终导致MS发病。Fall等[1]文献综述中研究的肥胖相关基因有57种，其中丝裂原活化蛋白激酶激酶5(Mitogen-activated protein kinase kinase 5,MAP2K5)-rs4776970的基因位点国内研究较少，我们通过此队列研究，探索MAP2K5基因与代谢异常及血管慢性炎症的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料:采集我院1224例健康体检人群，根据NCEP-ATPⅢ的中国人修订诊断标准将他们分为代谢综合征(MS)组和非MS组，其中MS组520例；非MS组704例。排除严重感染、肿瘤、血液病、肝病等。测量腰围(WC)、体重指数(body mass index,BMI)；收集高血压史、吸烟史、糖尿病史及其药物治疗情况、空腹血糖等危险因素。MS诊断：①男性腰围≥90cm，女性腰围≥80cm；②TG≥1.70mmoL/L；③HDL-C<1.29 mmoL/L(女)，HDL-C<1.03 mmoL/L(男)。血压≥130/85mmHg和降压药物治疗者；⑤FPG≥5.6mmoL/L和降糖药物治疗者。符合以上3项及以上。

1.2方 法

1.2.1实验室检查：使用真空采血管抽取空腹肘静脉血，4h内检测完毕。采用贝克曼库尔特公司AU5811全自动生化分析仪，测定甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)，日本积水株式会社提供LDL、HDL、hs-CRP试剂及校准品，AUTEC DIAGNOSTICA公司提供TGCHO试剂及校准品。利德曼公司提供血糖试剂及校准品检测空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)，采用日本东曹公司提供的糖化血红蛋白仪HLC-723G8及试剂、质控、校准品测定糖化血红蛋白(HbA1C)。

1.2.2DNA提取：EDTA-K2抗凝血2mL，按照TIANGEN公司提供的DNA提取试剂盒操作说明进行DNA的提取，-80℃冰箱备用。

1.2.3SNP检测：MAP2K5-rs4776970等位基因采用特异性引物(ARMS原理)，通过特异引物与TaqMan探针和公用引物建立的2个反应体系的Ct值测定不同等位基因，根据ΔCt(ΔCt=野生引物反应体系Ct值-A突变引物反应体系Ct值)来判定基因型。各序列见表1。

表1 ARMS-双TaqMan方法检测肥胖相关基因位点突变引物及探针序列

PCR分型反应体系为天根生化科技(北京)有限公司提供，20ul，DNA 2ul，2× Master mix 8ul和Ehance inhibit1ul，MAP2K5-rs4776970上、下游引物各1ul(终浓度0.25uM)，探针各1ul(0.25uM)，水3ul。95℃2min，95℃15s、60℃1min(共40个循环)作为反应条件。使用美国ABI公司的7500荧光定量PCR仪。任意选取分型后的MAP2K5-rs4776970不同等位基因型各3例，经北京诺赛基因组研究中心测序证实100%符合。

1.3统计分析:采用SPSS13.0软件进行分析。两组间计量资料比较采用独立样本T检验，计数资料比较采用χ2检验。基因分型与MS间的独立相关性用Logistic回归分析。三组间比较使用ANOAN方差分析,以P<0.05认为其差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组基线资料比较:MS组合非MS组人群的基本资料见表2，除了WC、舒张压、收缩压、TG、HDL-C、FPG这些纳入分组标准的指标有差异外，MS组年龄、HbA1c、Hs-CRP水平显著高于非MS组，差异有统计学意义(P<0.001)；TC、LDL-C水平MS组与非MS组比较，无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 1224例研究对象基础资料

2.2MAP2K5-rs4776970基因型在MS中频率分布:1224例研究对象中MAP2K5-rs4776970等位基因分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.073，P=0.787)，具有群体代表性。MS组中MAP2K5-rs4776970的AA型(7.5% vs 4.0%)分布频率显著升高(P<0.05),TT型(56.2%vs 59.5%)、TA型(36.3% vs 36.5%)的分布频率两组间无明显差别(P=0.954)，A等位基因频率在MS组中的发生率显著高于非MS组(25.7% vs. 22.2%，P=0.048)见表3。

表3 MAP2K2-rs4776970基因型在MS中分布频率n(%)

2.3MAP2K5-rs4776970基因型发生MS的危险性：对年龄和性别校正后，Logistic回归分析表明，MAP2K5-rs4776970基因型与MS患病无显著相关性(OR值为0.851，95%CI：0.7-1.035，P=0.106)。

2.4MAP2K5-rs4776970各基因型临床资料比较：MAP2K5-rs4776970三个基因型与WC、BMI及Hs-CRP相关(P=0.015；P=0.011；P=0.049)，进行任意两组的比较,结果提示AA型的BMI、WC与TT型比较有显著差异(P<0.01)；与TT型比较AA型的Hs-CRP及TA型的WC差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表4。

表4 MAP2K2-rs4776970基因型之间临床资料比较

3 讨 论

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是丝/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，是真核细胞的转导反应中重要的信号系统。其信号转导通路中三种激酶(MAP3K、MAK2K、MAPK)通过磷酸化依次激活，影响基因调控转录，调节细胞增殖、转化、分化和凋亡、参与炎症应激反应等重要病理生理过程。MAP2K中的MAP2K5是激活细胞外信号调控的蛋白激酶(ERK)5的重要激酶，对激活细胞外信号调控有重要作用，可以介导不同的生物学效应，对于细胞生存、增殖分化起着极其重要的作用。MAK2K5与肥胖、BMI、IR、瘦素等密切相关[2,3]。MAP2K5-rs4776970位于15q23，它参与激活的大MAPK通路(BMKI)在动脉粥样硬化引起的心血管疾病中作用重要，可维持血管生成、完整性及心脏发展，使心室肥厚，增加心脏功能，还与细胞外及神经生长因子的作用相关[4]。

本研究显示，年龄、HbA1c、hs-CRP水平MS组显著高于非MS组，它们之间的差异有统计学意义(P<0.001)，提示该基因位点与糖代谢、肥胖及血管炎症密切相关。其中AA型(7.5%vs 4.0%)分布频率显著升高(P<0.05)，A等位基因与MS相关(P=0.048)，是MS的遗传危险因素。这可能与MAP2K5激活BMKI通路参与下丘脑瘦素-黑皮质素体重调控有关，瘦素通过作用于中枢神经系统调节能量代谢引起肥胖，肥胖是导致MS的发病的重要因素。付俊玲等[5]的一篇关于3506名中国儿童的研究显示该基因位点与儿童肥胖也显著相关(P=0.004)，特别是BMI、WC与血压(P=0.02;P=0.02;P=0.03)，与瘦素、脂肪量呈正相关(P=0.013；P=0.014)，介导肥胖的原理可能是通过中枢神经的“瘦素抵抗”，激活ERK通路，对胰岛素信号通路发挥了负调控作用。内脏脂肪较易分解成游离的脂肪酸，沉积后导致机体糖代谢障碍，也可通过释放出炎性因子及引起胰岛素抵抗来参与MS发病，同时慢性炎症也增加了血糖控制不良的T2D患者发生心肌梗死和感染疾病的风险。在控制了性别年龄后，MAP2K5-rs4776970与MS无显著相关(P=0.106)，说明该基因型与MS的关系可能与年龄增长有关。

hs-CRP是一个炎性指标，排除急性炎症情况，可用来间接反映血管的慢性炎症程度，对评估动脉粥样硬化程度，有效预测心脑血管疾病敏感性高。本研究中MS组与非MS组的hs-CRP水平差异显著，提示MS人群存在血管慢性炎症，且携带AA基因型的人群hs-CRP水平明显高于携带TT型的人群，更易发生血管炎症。MAP2K5参与调控了多种致炎因子诱导的细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子、基质金属蛋白酶和单核细胞趋化因子的表达，促进炎症反应，诱发血管内皮细胞的功能紊乱，在早期的动脉粥样硬化发生中起到关键作用[6]。炎性反应是MS的诱发因素，通过多种机制参与其发生、发展。

综上，本研究提示，MAP2K5-rs4776970基因多态性与肥胖、糖代谢异常及血管慢性炎症相关，MAP2K5-rs4776970AA基因型及A等位基因频率在MS人群中比例更高，但其不是MS发生的独立危险因素。本研究还缺乏大样本前瞻性研究，以明确MAP2K5- rs4776970位点基因多态性与异常代谢及血管慢性炎症的相关性。减少肥胖，降低MS的发生，可能是降低新型冠状病毒感染重症率和死亡率的有效方法。