咳嗽变异性哮喘豚鼠模型的比较和评价研究

徐方蔚，陈海鹏，霍婧伟，路 晨，李盼盼，陈宇航，廖欣婷，吴力群

(1.北京中医药大学，北京 100078 2.北京中医药大学东方医院儿科，北京 100078)

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以咳嗽为惟一或主要症状的特殊类型哮喘，也是儿童慢性咳嗽中最常见的疾病。其发病机制与典型哮喘相似，是由多种炎性细胞共同参与的气道慢性炎症，并由此引起的气道高反应性[1]。但在关于CVA动物模型的研究中目前尚无明确区别于一般典型哮喘动物模型建立方法的报道[2]。本课题组长期致力于儿童咳嗽变异性哮喘的临床及基础研究，参照哮喘豚鼠模型进行改良，观察三种CVA豚鼠造模方法在气道反应性、气道炎症和病理方面的差异，评价各模型的效度及信度。

1 实验材料

1.1实验动物:雄性健康SPF级Hartley豚鼠，30只，约3周龄，体重230～280g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：[动]SYXK(京)2019-0013。豚鼠为群居动物不宜单笼饲养，按体型每笼3～5只为宜。

1.2试剂和仪器

1.2.1卵蛋白(OVA)：索莱宝(Solarbio)公司，Lot No：421C033。氢氧化铝：国药集团化学试剂有限公司，批号：20131125。乌拉坦：SIGMA公司，批号：MFCD00007966。辣椒素：源叶生物有限公司，20mg，批号：P12D9S77366。环磷酰胺：Coolaber公司，1g，Lot No：CC29183901。

1.2.2辣椒素溶液配制:即配即用，取辣椒素，加入吐温-80溶液、无水乙醇以及生理盐水，配成10-4moL/L的辣椒素溶液[3]。

1.2.3乙酰甲胆碱溶液:分别配制成0.08mg/mL，0.04mg/mL和0.02mg/mL的溶液。

1.2.4雾化器:飞利浦Philips公司生产Sami型雾化器，雾化器输出流量5L/min。

1.2.5小动物肺功能仪:Ani Res2005动物肺功能仪及分析软件系统。

2 实验方法

2.1造模:将实验动物按体重由低到高分层随机，分为4组，分别为正常对照组、模型A组、模型B组，模型C组，对照组6只，其余每组8只豚鼠。动物模型参考文献[4]制定。模型A：第1天每只豚鼠注射2% OVA和200mg氢氧化铝的混悬液1mL；第8天每只豚鼠注射0.01mg OVA和100mg氢氧化铝的混悬液1mL加强致敏1次；第15天起，用1% OVA溶液雾化(雾化率3mL/min持续时间20s并逐渐延长雾化时间至90s攻击)，隔日一次，共7次。模型B：第1天肌注4% OVA溶液0.5mL，同时腹腔注射2% Al(OH)3 0.2mL致敏；第15天起，用1% OVA溶液雾化，方法同前，隔日一次，共7次。模型C：第1天腹腔内注射免疫抑制剂环磷酰胺(30mg/kg),第3天每只豚鼠注射2mg OVA和200mg氢氧化铝的混悬液1mL，第22天腹腔注射0.1mg卵蛋白和100mg氢氧化铝混合液加强免疫免疫反应；第23天起用1% OVA溶液雾化，方法同前，隔日一次，共7次。正常对照组给予同样剂量的生理盐水。

2.2观察指标

2.2.1气道敏感性(咳嗽反应的测定)1% OVA最后一次雾化攻击后的第2天，将豚鼠置于密闭空间雾化吸入10-4moL/L辣椒素溶液60s，然后关掉雾化器，停留60s后掀开盖子取出豚鼠，记录此时开始2min内各豚鼠的咳嗽次数。

2.2.2气道高反应性的测定:采用动物肺功能检测系统(PFT系统)，观察豚鼠气道阻力(RI)的变化。选取20%乌拉坦溶液按1g/kg对各组豚鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉，备毛，分离气管及颈外静脉，行气管插管并固定，分离两侧颈静脉，穿好线备用。将豚鼠仰卧平放体描箱内(必要时可将豚鼠颈部垫起抬高)，将气管插管与呼吸机连接，颈外静脉穿刺并固定，连接外接注射装置，密封体描箱。小动物呼吸机呼吸频率设定为65次/min，潮气量设定为6mL/kg。待呼吸稳定后，测定此时基值，然后进行激发，激发试剂和顺序分别为:0.5mL生理盐水及浓度为0.02、0.04、0.08mg/mL的乙酰甲胆碱各0.5mL。每次注射后记录下每个浓度级别下的RI值及对应的时间，待气道总阻力降至正常后开始下一个剂量的注射。

2.2.3支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集和BALF中嗜酸性粒细胞计数:结扎左肺门，通过气管插管，以较小的压力将5mL生理盐水缓慢注入肺中，可见右肺逐渐变得膨隆、苍白，停留30s后，缓慢回抽灌洗液，注入橙色帽管内，重复上述操作3次。将收集的BALF进行4℃离心，1500r/min，10min，立即取细胞沉渣进行嗜酸性粒细胞直接计数，并计算出嗜酸性细胞的百分率。

2.2.4肺组织HE染色:收集BALF之后快速结扎右肺门，在左心耳剪开一口，从右心房进针进入肺主动脉，缓慢推入生理盐水，将豚鼠肺中血水冲出，再用4%多聚甲醛的PBS从气管缓慢注入，见左肺轻度膨隆即可。剪下左肺中下叶置于福尔马林中保存固定。将固定好后的肺组织常规进行石蜡包埋，4μm切片，用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，水干后苏木素染色5min，清水冲洗吹干后用盐酸乙醇分化30s，用清水浸泡15min后吹干，置伊红液2min，再进行脱水、透明、中性树脂封固。参考文献[5]拟定病理切片量化分级标准，主要从血管及支气管嗜酸性粒细胞浸润、水肿及上皮细胞损伤程度三个方面进行评价。

3 结 果

3.1豚鼠咳嗽次数:各组豚鼠咳嗽次数见表1。在实验观察中模型A及模型B中各有2只豚鼠在卵蛋白雾化后即出现明显喘息，辣椒素刺激后亦出现明显的喘咳。

表1 各组豚鼠辣椒素刺激后咳嗽次数的比较

3.2豚鼠气道高反应性:各组豚鼠在激发后的气道阻力变化如图1，每组各得到4组RL值(分别为注射生理盐水、MeCh0.02、0.04、0.08mg/mL时的RL值)，见表2。对比空白组，对于生理盐水、MeCh0.02、0.04、0.08mg/mL，P<0.05，差异有统计学意义。3组模型组之间两两比较有差异，P<0.05。在MeCh0.04mg/mL剂量下气道阻力A组>B组>C组。

表2 不同剂量乙酰甲胆碱激发试验气道总阻力曲线下面积(RL-area)比较(cmH2O/mL)

图1 各组豚鼠在不同浓度乙酰甲胆碱激发后气道阻力变化

3.3 BALF中嗜酸性粒细胞百分比:各组BALF中嗜酸性粒细胞百分比见表3。与空白对照组比较，3个模型组豚鼠的BALF中嗜酸性粒细胞百分比明显升高(P<0.05)，而3个模型组间比较中，虽然如图2所示，模型B组的百分比增高明显，但组间差异无统计学意义(P=0.051)。

图2 各组豚鼠BALF中嗜酸性粒细胞百分比

表3 各组豚鼠BALF中嗜酸性粒细胞百分比的比较

3.4各组豚鼠肺部病理结果:空白组豚鼠气道结构正常，未见明显炎性细胞浸润；各模型组气道表现气道上皮细胞被破坏，黏膜下大量炎症细胞浸，气道平滑肌增生。见图3。根据豚鼠肺部病理分级评分，空白组为(2.4±0.20)分，模型A组(6.4±0.34)分和模型B组(7.8±0.51)分以及模型C组(6.4±0.36)分，3个模型组豚鼠的肺组织病理学评分明显升高(P<0.05)，以模型B组升高明显，但是3个模型组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图3 各组豚鼠肺组织HE染色结果

图4 各组豚鼠肺组织病理炎症分级评分

4 讨 论

4.1三种造模方法的比较:在造模方法上，由日本金泽大学研究并引入的咳嗽变异性哮喘豚鼠模型，给我国CVA动物实验模型提供了一个很好的参考[6]。但该造模方法激发时只用1%OVA雾化1次，持续90s，在本研究团队前期实验过程中发现，由于豚鼠个体差异性较大，对于激发时间有豚鼠10s即出现高度的气道痉挛，如不进行及时抢救会出现窒息死亡。故雾化刺激时，从10s开始逐渐适应性延长，且CVA属于慢性咳嗽的一种，针对慢性炎症模型的建立方法与急性相比，主要区别在于激发时间更长。谭杰军等[7]研究为了更好地模拟气道慢性炎症过程这一哮喘本质，延长了雾化激发时间，为连续激发14d，本研究避免长时间OVA刺激而产生的脱敏效应，改为OVA激发隔日一次，共7次，从而可形成典型的慢性变应性炎症模型。近几年，国内多家实验中心也在该模型基础上进行了方法上的改进。本实验研究查阅国内外文献后筛选三种CVA豚鼠造模方法，在致敏阶段进行借鉴，各方面比较见表4。

表4 三组造模方法的具体比较

4.2模型评价标准:与临床诊断相类似，没有严格的标准来区分咳嗽变异性哮喘和典型哮喘，目前也没有明确的评价标准来界定CVA动物模型和支气管哮喘动物模型。因此建立与临床症状相似度更高的CVA动物模型以及合适的模型评价标准也是开展CVA研究的关键问题。判断一个CVA动物模型是否成功可以在哮喘本质认识的基础上，看所造模型是否有如下变化：①造模后行为学表现(主要表现为刺激后咳嗽)；②肺组织HE染色是否炎性细胞浸润，是否以嗜酸性粒细胞(EOS)为代表；③BALF中细胞计数，重点是以EOS是否升高；④肺功能指标，如RI、RL、Re等。具体判定时也应从这三个方面与哮喘模型区分：①气道激发试验时，其气道阻力应较哮喘轻，且气道阻力也应随着激发浓度升高而逐渐上升；②肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞计数较哮喘的少；③行为学上无明显喘息症状。

哮喘动物模型的行为学分级标准：共分4级，分别为呼吸困难，咳嗽，跌倒，死亡。而咳嗽变异性哮喘模型没有明确的行为学标准，一些研究按哮喘动物模型的行为学分级标准进行判定是不准确的，按照咳嗽变异性哮喘的临床症状应以咳嗽作为主要判定标准，指南[8]中推荐引起咳嗽5次的最低辣椒素浓度来对咳嗽敏感性进行描述，而一般动物实验中常采用固定辣椒素浓度进行检测，以咳嗽次数作为敏感性的判定标准，故本实验研究暂定5次为最小次数标准。研究结果中，三组模型的咳嗽次数均达到5次以上，但相比于其他类似的实验研究结果，本次咳嗽次数相对较少，考虑与激发物、激发物浓度以及激发时间和观察时间均有相关。在激发时间上不同文献均有差异，王谦等[4]研究通过反复造模摸索发现0.5mmoL/L辣椒素雾化2min，在此条件下豚鼠咳嗽频次计数较为可靠。大部分研究的观察时间在2min，但在本研究中发现，2/3的豚鼠在结束激发后并不立即出现咳嗽，而在2min后出现频繁的咳嗽，故可将观察时间延长为3min。

从病理切片上看，空白组豚鼠支气管结构正常，未见明显的炎性细胞浸润；各模型组豚鼠肺组织病理表现：①支气管壁局部黏膜上皮可见损伤及脱落；②各层管壁可见充血、水肿；③支气管周围可见大量炎性细胞浸润，并以嗜酸性粒细胞(图中红色颗粒状)为主。如图3中所示，其中模型B损伤最重，可能与致敏药物浓度大有关。本研究采用Underwood[8]提出用于评估抗原攻击的豚鼠肺部炎症变化的组织病理学评分系统，主要对豚鼠肺组织血管及支气管嗜酸性粒细胞浸润、水肿、上皮细胞损伤三个方面进行评分评估，依据每个方面的严重程度给予0～5分的评分，评分高的说明组织的炎症浸润程度也越高。三个模型组BALF中嗜酸性粒细胞比例也明显增高，说明三种方法造出的豚鼠CVA模型肺部病理上均是成功的。

在中华医学会儿科分会呼吸学组关于CVA的诊断标准中提到患儿肺功能正常，支气管激发试验提示气道高反应性，故有必要将小动物肺功能检测纳入到评价指标中。在实验结果中三组模型的气道阻力较空白组均有增大，但模型A、B组的气道阻力过高，结合二组中均有豚鼠出行喘息症状，考虑模型症状偏重，更类似于哮喘，而模型C组气道阻力表现更为平稳。本实验的肺功能测定是通过采用有创的方法实现的，需要行颈静脉穿刺术，将激发试剂不同浓度的乙酰甲胆碱注射入豚鼠静脉内，检测其气道阻力。实验前备毛，分离静脉时尽量将包裹静脉的筋膜剥离干净，穿刺前注意针管的通畅，这些都影响穿刺成功率，该操作对实验研究人员技术要求较高，本次实验中B组中有2只豚鼠因穿刺术时间过长而死亡，相比Li等[9]采用无创方法所测定增强呼吸间歇(Penh)，操作简便，对动物伤害较少，且能重复操作，可以在不同的时间点进行多次测定，更能体现实验过程中豚鼠气道阻力的变化，从而有助于确定造模的时长、药物激发浓度等等。

综上，本试验研究三种模型的咳嗽症状和气道高反应性大致符合CVA的临床症状的特征，其中模型A与模型B中出现4只明显喘息的豚鼠，模型C的行为学表现和气道高反应性表现更为稳定。在BALF中嗜酸性粒细胞比例，A与C组的比例以及病理结果与临床上咳嗽变异性哮喘和典型哮喘的差别。由此我们认为所建立的模型C组造模方法可行性更佳，但关于CVA动物模型的评价标准以及检测指标上还需要更多的实验研究将其进行规范。