瑞舒伐他汀对脓毒症大鼠心肌自噬的影响*

齐心欣，顾忠民，刘宇箫

厦门大学附属福州市第二医院重症医学科，福建 福州 350007

脓毒症性心肌损害为严重脓毒症的常见并发症，其病死率较高，目前发病机制仍未完全明确［1］。自噬（autophagy)是细胞在基因调控下对胞内错误折叠的蛋白质及损伤的细胞器进行降解过程，其是维持细胞功能的重要生理活动，但过高或过低的自噬活动对机体有害。新近研究发现脓毒症心肌损害时存在自噬异常［2］，但其在病情发展中的作用未完全明确。瑞舒伐他汀（rosuvastatin,ROS）是新型亲水型他汀，其药理作用强、副作用相对较低，目前广泛应用于冠心病、脑梗塞等心脑血管疾病治疗［3］。新近有研究发现在帕金森动物模型中，ROS影响神经细胞自噬［4］，但相关研究仍很少。关于ROS是否影响脓毒症心肌细胞自噬、减轻心肌损害目前未见报道。故笔者通过实验比较脓毒症大鼠予ROS治疗后，血浆超敏肌钙蛋白I（High-sensitivity troponin I，hsTnI）、心肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferators-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）、微管相关蛋白1轻链3-II(microtubule-associated protein l light chain 3B，LC3-II)、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin,mTOR)及自噬效应蛋白Beclin-1的水平变化，探讨其影响脓毒症心肌自噬及减轻脓毒症心肌损害的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

24只6周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠，体重（200±10）g（上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK沪，2017-0005），按照随机数字表分为3组，即假手术组（Sham组）、脓毒症心肌损伤模型组（CLP组）、脓毒症瑞舒伐他汀给药组（ROS组），每组8只。

1.2 试剂及仪器

瑞舒伐他汀（阿斯利康制药有限公司，批号135508），大鼠hsTnIELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号m l059498），抗大鼠PGC-1α一抗（北京博奥森生物技术公司，批号bs-1832r)，抗大鼠LC3-II一抗（美国CST公司，批号#4108)，抗大鼠mTOR一抗（北京博奥森生物技术公司，批号bs-1992R），抗大鼠Beclin-1一抗（北京博奥森生物技术公司，批号bs-1353R），HRP goat anti-rabbit IgG（美国proteintech，批号SA00001-2），10%水合氯醛溶液（广州沛瑜生物制品有限公司），10%甲醛溶液（湖南尔康制药股份有限公司），RIPA裂解液（中国上海碧云天，批号P0013B），生物样品均质仪（中国杭州奥盛，型号BioPrep-24），台式冷冻离心机（中国湖南湘仪，H1650R），酶标仪(美国AWARENESS公司，型号Stat Fax 2100)，石蜡切片机（德国徕卡，型号RM2235），光学显微镜（日本Olympus公司，型号BX51TF）等。

1.3 方法

1.3.1 给药方法：Sham及CLP组于造模前连续5天，每日给予淀粉混悬液灌胃一次（混悬液配置为淀粉2.0 mg/kg.d溶于2 m l生理盐水）；ROS组于造模前连续5天，每日予瑞舒伐他汀混悬液灌胃一次（混悬液配置为ROS 2.0 mg/kg.d溶于2 m l生理盐水）；术前12 h禁食。大鼠瑞舒伐他汀治疗量以成人每日20 mg用量为基础，按照大鼠与人的药物剂量换算表计算出。

1.3.2 模型制作：CLP组及ROS组参考Hubbard WJ等人的实验方法［5］造模：大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 m l/kg麻醉，手术切开腹腔，结扎盲肠中段，在结扎处远端0.5 cm处用25号针头贯穿肠壁1次，挤出肠内容物，回纳盲肠并缝合关腹。Sham组同法开关腹，但不予盲肠结扎穿孔。3组术后皮下注射林格氏液50m l/kg，术后正常饮食、饮水。

1.3.3 标本采集：术后24 h三组大鼠予10%水合氯醛3.5 m l/kg腹腔注射麻醉后，眼球采血2 m l，分离血清（3 000 r/min离心20 min），-80℃冰箱保存待检hsTnI；取左心组织加入RIPA裂解液于生物样品均质仪中研磨成匀浆，4℃，12 000 rpm离心15 min分离上清液，待检PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1；取右心组织置入10%甲醛溶液保存24 h备光镜检查。

1.4 观察指标

1.4.1 血清hsTnI浓度测定分离血清标本按照ELISA试剂盒使用说明检测hsTn I浓度。

1.4.2 心肌PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1蛋白测定 取分离后组织上清液，加5×SDS上样缓冲液，98℃加热5 min，使蛋白变性，灌胶上样进行电泳。取出凝胶转膜，封闭，依次加入一抗、二抗并室温孵育，ECL显色曝光，并用quantity one专业灰度分析软件分析相关蛋白条带的灰度值，以相关蛋白条带的灰度值与内参条带的灰度值比值作为上述蛋白的表达水平。

1.4.3 心肌病理取固定后心肌组织，石蜡包埋切片，光学显微镜下观察三组大鼠心肌组织改变。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各 组 大 鼠hsTnI、PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1浓度比较

三组术后24 h hsTn I、PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1浓度间有显著差异（P<0.05）；与Sham组比较，术后24 h CLP、ROS组hsTnI、PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1浓度均升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与CLP组同期比较，ROS组hsTnI、PGC-1α及mTOR浓度均明显下降，LC3-II及Beclin-1浓度升高，差异亦有统计学意义（P＜0.05），见表1，图1。

表1 各组大鼠24 h hsTn I、PGC-1α、LC3-II、m TOR及Bec lin-1浓度比较（±s）

表1 各组大鼠24 h hsTn I、PGC-1α、LC3-II、m TOR及Bec lin-1浓度比较（±s）

注：三组间同期比较P＜0.05，CLP与Sham组同期比较a P<0.01，ROS与Sham组同期比较b P<0.01；ROS与CLP组同期比较，c P<0.05

组别Sham（n＝8）CLP（n＝8）ROS（n＝8）F t a t b t c hsTn I(pg/m L）309.50±31.80 1 524.00±93.97a 696.70±52.61bc 91.6 12.3 6.3 7.68 PGC-1α 15.92±4.49 63.56±9.27a 39.18±6.08bc 11.89 4.62 3.07 2.19 LC3-II 17.83±1.47 33.09±1.42a 40.47±2.55bc 37.32 7.46 7.67 2.52 mTOR 17.33±1.13 29.72±2.15a 24.12±1.29bc 15.21 5.08 3.96 2.23 Beclin-1 20.58±1.68 30.48±1.86a 41.09±3.22bc 18.76 3.93 5.63 2.84

图1 各组大鼠24 h PGC-1α、LC3-II、mTOR及Beclin-1的表达

2.2 各组大鼠心肌组织变化比较

Sham组心肌细胞结构清楚，细胞膜光整，细胞间隙未见渗出改变；CLP组心肌细胞肿胀、空泡变性、细胞结构不清甚至坏死，组织间隙见明显渗出，而ROS组心肌细胞变性、坏死及组织间隙渗出等病变较CLP减轻，见图2。

图2 各组大鼠心肌组织光镜结果(HE染色×400)

3 讨论

心脏是严重脓毒症最常受累的器官之一，目前研究提示多种机制参与了脓毒症心肌损害过程［1］。自噬被认为是维持正常细胞功能的自我保护机制，研究发现脓毒症时，免疫细胞内合适的自噬水平具有清除胞内微生物、抗原提呈及调节免疫等功能［6］。新近研究发现脓毒症时脂多糖、炎症介质、微循环障碍等多因素可造成心肌细胞胞内多种细胞器损伤，细胞通过适应性自噬增加，清除受损细胞器、炎症小体等避免细胞进一步损伤甚至坏死，自噬被认为是心肌细胞自我保护的机制［2］。然而随着脓毒症病情进展，胞内自噬减弱，出现细胞坏死，加重了器官功能障碍。药物干预能否影响脓毒症心肌自噬从而改善心肌存活等，目前都成为研究热点。目前研究发现他汀类药物除有调脂、稳定粥样硬化斑块作用外，还具有调节免疫、抗氧化反应等额外药理作用［3］。ROS是新型亲水型他汀，其药效强、体内清除路径多、不良反应较低。新近有研究发现在帕金森动物模型中ROS影响神经细胞自噬［4］，但是否影响脓毒症心肌自噬而减轻脓毒症心肌损害，目前未有报道，故本研究予探讨。

本实验大鼠予盲肠结扎穿孔造模，术后光镜下见大鼠心肌出现明显损伤甚至坏死，同期血清hsTnI明显增高，出现脓毒症心肌损害。目前研究认为脓毒症心肌损害患者早期即出现hsTnI水平增高，是预测患者早期死亡率的独立危险因素［7］。由于hsTnI可作为脓毒症心肌损害的重要生物标志物和预后指标，因此积极控制其水平对病情有重要意义。我们研究发现，ROS组hsTn I浓度有明显下降，心肌病理损伤减轻，提示瑞舒伐他汀可减轻脓毒症心肌损害。

PGC-1家族是一类核转录因子，调节多种基因的表达。PGC-1α是其中的一员，分布与心肌、肝等线粒体丰富的组织中，在转录水平调节胞内脂肪酸代谢蛋白的表达［8］。生理下心肌主要通过脂肪酸β氧化获得能量，病理下降低心脏细胞对脂肪酸的利用，可以满足心肌细胞的低耗氧要求［9］。脓毒症心肌损害时心肌线粒体受损，细胞氧利用障碍［1］，脂肪酸氧化加重细胞缺氧损伤。本实验发现CLP组PGC-1α水平明显增高，同期心肌病理损害严重，提示CLP时心肌脂肪酸代谢不利于细胞存活。我们发现治疗组PGC-1α水平下降，心肌损害减轻，提示ROS通过影响其表达可减轻脓毒症心肌损害。目前研究发现PGC-1与自噬间存在一定联系，但具体关系通路及合适的表达水平未完全明确，有待进一步研究［10-11］。

LC3-II蛋白目前认为是胞内自噬发生的标志蛋白［12］。当自噬诱导产生后，细胞内LC3-I蛋白经泛素样修饰后转变为LC3-II，其促进胞内自噬小体的形成，通过检测LC3-II蛋白量，可反映胞内自噬水平。mTOR通路是最主要的自噬激活通路，mTOR水平下降可激活自噬［13］。目前研究发现mTOR通路参与了脓毒症心肌损害［14］。本实验发现CLP及ROS两组光镜及hsTnI水平支持出现脓毒症心肌损害，同期LC3-II水平增高，提示脓毒症心肌损害时心肌细胞存在自噬。然而CLP组mTOR水平明显增高，LC3-II水平下降，提示CLP组心肌自噬受到抑制，细胞损害明显。ROS组通过降低mTOR水平，增强了胞内自噬，从而减轻心肌损害。目前认为Beclin-1通过与PI3-Atg14相互作用，促进自噬进程，其介导的细胞信号传递链是另一组重要的自噬正反馈通路。近来发现通过激活Beclin-1表达，可减轻脓毒症心肌损害［15］。本实验发现CLP组自噬受限，同期Beclin-1水平下降，ROS通过增强其表达，改善自噬，减轻心肌损害。

综上本研究提示脓毒症心肌损害时，hsTnI和PGC-1α等反映心肌损伤的因子水平明显增高，同期胞内自噬相关蛋白如mTOR、Beclin-1及LC3-II等表达异常，自噬活动受限。ROS通过影响自噬因子表达，减轻脓毒症心肌损害，其为临床用药提供一定的治疗依据。