马香苓口服液中白术内酯Ⅲ含量测定方法的建立

杨洪早,李锦宇,王东升*,张世栋,董书伟,闫宝琪,那立冬,吴春丽,邓 俊,吴冠连,陈新丽,赵留涛,朱 凯, 梁永喜,严作廷,2*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050; 2.农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃兰州 730050;3.郑州大学药学院，河南郑州 450001; 4.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

马香苓口服液是由广藿香、白术、马齿苋等制成的纯中药口服液，临床主要用于治疗病毒引起的仔猪腹泻。研究表明，该制剂工艺稳定可行，无刺激性，治疗仔猪腹泻总有效率达96%，治愈率达90%。为进一步控制该制剂的质量，便于临床药效学研究，故对该方剂做其定量的方法研究[1-2]。白术具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎之功效；用于脾虚食少，腹胀泄泻，痰饮眩悸，水肿，自汗，胎动不安[3]。在马香苓口服液中作为臣药，它的主要成分作用为白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮等，该类成分具有调节胃肠道功能和促进营养物质吸收的作用，也是控制白术药材质量的主要指标之一[4]。据报道[5]，其白术内酯Ⅲ含量可以作为评定中药散剂、口服液水提工艺等指标。因此，采用高效液相色谱法(HPLC)测定本制剂中白术内酯Ⅲ的含量并做方法学研究，可以为该制剂的质量标准提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 白术内酯Ⅲ(含量99.9%，20 mg，批号：11978-201501),中国食品药品检定研究院产品;马香苓口服液，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制(批号20160324、20160616、20160623、20160625、20160704、20160705、20160712、20160714、20160717、20160721);甲醇(色谱纯，规格1 L，批号20161006)，天津川普伟业科技有限公司产品;水为超纯水，石油醚(60℃～90℃，批号20160901)烟台市双双化工有限公司产品;其余有机试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备 DIONEX UItiMate 3000高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司产品；NewClassic MS 电子天平，梅特勒-托利多上海有限公司产品；Milli-Q型超纯水机，美国Millipore公司产品；KQ 3200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品。

1.1.3 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6 mm×250 mm，美国Agilent Technologies)，以水和甲醇为流动相梯度洗脱(表1)，流速0.8 mL/min，柱温25℃，检测波长223 nm，进样量30 μL。

1.2 方法

溶液制备：以甲醇和500 mL/L甲醇水溶液为空白溶液。精密称取白术内酯Ⅲ1.46 mg，置2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，密封，摇匀，即得浓度为0.73 mg/mL的对照品储备液。精密移取白术内酯Ⅲ标准储备液1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为0.073 mg/mL，作为白术内酯Ⅲ对照溶液。量取中药口服液25 mL于125 mL分液漏斗，加石油醚(60℃～90℃)振摇提取4次，每次40 mL，收集上层石油醚有机溶液，水浴挥干(水浴锅温度90℃)，残渣加500 mL/L甲醇水溶液使其溶解，并定容至10 mL容量瓶，即得供试品溶液。取按处方比例并以同样制备工艺的缺白术的阴性对照口服液，按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。

表1 流动相梯度

2 结果

2.1 专属性试验

取空白、对照品、供试品和阴性对照溶液，过0.22 μm有机微孔滤头于1 mL进样瓶中，密封，参照文献[2]并按色谱条件自动进样测定，每个样品进样2次，记录色谱图(图1)，结果白术内酯Ⅲ对照品溶液理论板数为13327；在与白术内酯Ⅲ对照品溶液色谱峰对应的位置上，供试品(26.063 min)与其对照品(26.419 min)保留时间一致，其理论塔板数为21420，且与其他组分分离度大于1.5；阴性对照溶液在对照品与供试液相应的保留时间内未检出色谱峰，表明样品中其他成分不干扰白术内酯Ⅲ的测定。

2.2 线性关系考察

精密量取白术内酯Ⅲ对照液1 mL于2 mL容量瓶，加色谱甲醇定容至刻度，依次进行倍比稀释得系列标准溶液，其浓度分别为73.00、36.50、18.25、9.13、4.56、2.28μg/mL，按色谱条件自动进样上述系列溶液各30 μL，每个浓度进样2次，记录色谱图并测定峰面积。以白术内酯Ⅲ峰面积(y)纵坐标，检测质量浓度(x，μg/mL)为横坐标进行线性回归(图2)，得回归方程y=1.356 7x+0.857 6，R2=0.992，结果表明，白术内酯Ⅲ检测质量浓度在0.57 μg/mL～73.00 μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验

精密量取对照品溶液，按色谱条件自动进样30 μL，连续进针6次，记录色谱图，测定峰面积。计算结果保留时间RSD=3.04%，相对峰面积RSD=2.00%，表明仪器精密度良好。

图1 专属性试验(高效液相色谱图)

2.4 重复性试验

取同一批中药口服液，按供试品溶液制备法平行制备6份。按色谱条件进样30 μL，每个样品连续进样2次，记录色谱图，测定峰面积。计算结果得相对峰面积RSD=6.00%，表明本方法重复性良好。

2.5 稳定性试验

取同一批中药口服液(批号：20160721)，按供试品溶液制备法制备，考察其日内精密度与日间精密度。分别于0、2、4、8、12、16、24 h内及在0、12、24、36、48、60、72 h之内分别精密量取供试液，按照色谱条件进样30 μL，每个样品进样2次，记录色谱图，测定峰面积。计算结果得24 h内平均含量2.27 μg/mL，相对平均含量RSD=8.14%，相对峰面积RSD=6.00%；72 h内平均含量2.20 μg/mL，相对平均含量RSD=9.54%，相对峰面积RSD=8.58%，表明本方法在72 h内重复性、稳定性良好。

图2 白术内酯Ⅲ标准曲线图

2.6 加样回收率试验

精密称取白术内酯Ⅲ 5.98 mg于5 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，得其浓度为1.196 mg/mL白术内酯Ⅲ对照液，根据前期研究算出供试液含量，特此进行配制高、中、低3个不同标准品浓度作为加样标液，分别取0.6、0.5、0.4 mL于10 mL容量瓶，加甲醇稀释并定容至刻度，得其加样标液浓度分别为71.76、59.8、47.84 μg/mL。

精密量取同批次(批号：20160721)中药口服液置于分液漏斗中，分为9份，每份样品液为25 mL，分为高中低3组，每3份口服液为1组，各分别精密加入1 mL白术内酯Ⅲ对照液于分液漏斗中，混匀，按供试品溶液制备法制备，即得加样回收供试液。按色谱条件进样，每个样品进样2次，记录色谱图，测定峰面积，并计算含量与回收率。其平均回收率为98.04%，RSD=11.89%，表明回收相对较好(表2、表3)。计算公式为：测得加入量=测得总量-中药口服液本身含有量，回收率=测得加入量/实际加入量×100%

表2 加样标液高、中、低浓度与未加标样马香苓口服液20160721批供试液结果

2.7 耐用性试验

研究的变动因素主要有：柱温分别为20℃、25℃、30℃，流速0.8 mL/min，色谱柱为ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm,Agilent Technologies)；流速分别为0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min，柱温25℃，色谱柱为ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm,Agilent Technologies)；色谱柱分别为ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm,Agilent Technologies)、PhenomenexGemini C18 110A(5 μm×250 mm×4.60 mm)、Vydac 218 TP C18(5 μm×250 mm×4.60 mm， Grace)，柱温25℃，流速0.8 mL/min。

按以上变量色谱条件进样，其中白术内酯Ⅲ对照液(73μg/mL)进样10 μL，20160721批供试液进样30 μL，每个样品进样2次，记录色谱图，测定峰面积。当柱温改变，其他条件不变时，相对保留时间RSD=0.44%，相对含量RSD=4.15%；当流速改变，其他条件不变时，相对保留时间RSD=1.25%，相对含量RSD=3.49%；当换用不同型号色谱柱，其他条件不变时，相对保留时间RSD=0.64%，相对含量RSD=8.20%。从相对RSD值来看，不同型号色谱柱对保留时间差异最小，对其含量变化值相对较大；柱温和流速的改变对其保留时间和含量变化差异均较小(表4～表6)。

因此，在测定白术内酯Ⅲ含量时柱温应保持在25℃，流速保持在0.8 mL/min，选用Phenomenex Gemini C18 110A(5 μm×250 mm×4.60 mm)柱子进行测定，其所得含量相对较高、稳定且峰形较好，进样重复性好。

2.8 10批样品含量测定

分别取10批样品(批号：20160324、20160616、20160623、20160625、20160704、20160705、20160712、20160714、20160717、20160721、20160724)按供试液法每批次各平行制备2份供试液，按色谱条件自动进样测定，其对照液白术内酯Ⅲ(浓度71.76 μg/mL)分别进样30、20、10 μL，且每个进样量分别进样2次；每份供试液各进样2针，记录色谱图和峰面积，并计算含量以及RSD值(表7)，计算得马香苓口服液中白术内酯Ⅲ不同进样量含量分别为2.15、2.58、2.54，平均含量为2.43 μg/mL，相对含量RSD=9.82%。考虑到大规模生产中的各种损失和测量误差，取其平均值的80%作为其含量限度，即2.43×0.80=1.94，故暂定马香苓口服液中白术药材按白术内酯Ⅲ计不少于1.94 μg/mL。

表3 马香苓口服液中白术内酯Ⅲ加样回收率试验结果(n=9)

表4 柱温耐用性考察

3 讨论

3.1 待测组分选择

白术的内酯类成分具有抗炎、增强免疫、利尿等作用，而且还可以调理胃肠道和促进营养物质的吸收，其中白术内酯Ⅰ、Ⅲ的药理作用较为明显，也是发挥白术健脾益气、燥湿利水的功效之一[6]。在炮制过程中苍术酮被氧化，其产物是双白术内酯、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ，同时白术内酯Ⅲ在经高温加热过程中会生成白术内酯Ⅱ[7-8]；从氧化反应机制来看，苍术酮易与水发生加成反应，生成半缩醛羟基，而水又导致半缩醛羟基开环生成羰基，羰基进一步被氧化生成羧基，杂化轨道平面两侧容易被羟基进攻羧基，羟基并与羧基进行分子内脱水反应，可生成白术内酯Ⅰ和表白术内酯Ⅰ，而白术内酯Ⅰ在7位上与碳相连的氢相比较为活跃，易被羟基取代而生成白术内酯Ⅲ[9]。白术内酯Ⅲ的结构较其稳定，更有利于含量测定。

表5 流速耐用性考察(0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min)

表6 不同色谱柱耐用性考察

表7 马香苓口服液10批样品含量测定结果(n=2)

3.2 供试液前处理

按照萃取溶剂的方法，考察了正丁醇、石油醚(30℃～60℃)、石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯等有机溶剂，经过与标准品色谱法相比较，石油醚(60℃～90℃)所萃取得到的供试液峰形较好，分离度高，但其前面有一小杂峰，后改用甲醇、500 mL/L甲醇水溶液、乙醇、750 mL/L乙醇等作为复级溶液，考虑到白术内酯类成分的稳定性，并同时选择了考察柱温的最佳条件(20℃、30℃、35℃)，结果表明，在柱温为25℃、选用500 mL/L甲醇水溶液作为复级溶液，所出的峰形分离度高，峰形对称且含量较高。有关提取次数优选，在其他相同条件下，用石油醚(60℃～90℃)振摇提取3～5次，结果表明，用供试品提取3次与4、5次有较大差异，而4、5次时白术内酯Ⅲ含量无明显差异，故选择用石油醚(60℃～90℃)振摇提取4次[10-11]。

3.3 色谱条件选择

本制剂通过单因素试验，对其柱子型号、柱温、流速、流动相比例进行优化和系统适用性试验以及波长的选择，用紫外分光光度计测量白术内酯Ⅲ的最大吸收波长，结果在223 nm处吸收峰最强[12-13]；在流动相选择上参考其他学者研究，用标准品白术内酯Ⅲ进行判定等度条件下使用甲醇-水(60∶40)、乙腈-水(60∶40)的出峰情况，试验表明用甲醇-水(60∶40)对其标准品的峰更好，含量更高，同样条件下进样测定供试液，发现其分离度达不到《中国兽药典》的要求，杂峰较多，故进行了梯度洗脱，考虑中药成分复杂多样，会影响色谱柱的质量以及下一针进样的出峰情况，故在样品目标峰等完全出完过后使用了纯甲醇进行冲洗色谱柱10 min，然后用15 min再平衡到流动相的初始比例以方便下一针进样分析，最终确定了流动相条件[14-15]。在其他条件不变情况下，柱温的改变对其供试品溶液中白术内酯Ⅲ含量的相对标准偏差为4.15%，且柱温过高，易导致峰形不对称，有拖尾现象，综合考虑，最终选用柱温为25℃；在柱温25℃等其他条件不变情况下，改变流速0.8 mL/min±0.2 mL/min，发现供试品溶液中白术内酯Ⅲ含量相对标准偏差为3.49%，说明改变流速对样品中白术内酯Ⅲ的测定无影响，对其样品出峰时间早晚有一定影响，但对峰的对称性、分离度无影响[16]，故最终确定流速为0.8 mL/min。

试验证明以流动相甲醇-水(体积比)进行梯度洗脱(甲醇60→65、水40→35运行30 min，甲醇65→100、水35→0运行2 min，甲醇100、水0运行10 min，甲醇100→60、水0→4运行3 min，甲醇60、水40运行15 min)、检测波长223 nm、柱温25℃、流速0.8 mL/min的色谱条件对白术内酯Ⅲ的测定具有较强的专属性，能达到基线平衡、与其他组分离度较高、峰形对称、阴性对照无干扰、大大缩短分析时间，便于作为含量测定和方法学研究。

建立的HPLC方法测定白术内酯Ⅲ含量的线性关系良好，精密度、重复性、稳定性试验的平均峰面积RSD分别为2.00%、6.00%和8.58%；平均加样回收率为98.04%，RSD=11.89%，其回收率相对良好，进行10批样品的含量测定，暂定马香苓口服液中白术药材按白术内酯Ⅲ计不少于1.94 μg/mL。表明所建立的HPLC特征图谱专属性强、准确可行、简便，可快速用于鉴别马香苓口服液中白术内酯Ⅲ以及其含量，可有效地用于该制剂的质量控制，同时该方法还可以为进一步加强含白术类化合物的制剂质量控制提供参考，为申报新兽药质量标准提供一定的数据支撑。