非侵入性血流检测法辅助卒中后抑郁模型的建立

李 笨，严苏杭，孙文超，肖朋朋，李 楠，李 昌，鲁会军，金宁一，王茂鹏*

(1.温州大学病毒学研究所，浙江温州 325035；2.军事医学研究院军事兽医研究所，吉林长春 130122)

近年来，脑卒中在我国的发病率越来越多[1]。情绪障碍是卒中患者常见的并发症，其中卒中后抑郁发病率较高，严重影响患者的预后治疗,降低患者的生活质量[2-3]。卒中后抑郁发病的机制尚不完全明确，临床治疗效果欠佳，因此，良好模拟临床上卒中后抑郁患者的动物模型开发与应用工作迫在眉睫。

研究发现，大脑前额叶皮层、基底核、中缝核等组织结构的病变可使卒中后抑郁的几率更高[4-5]。近年来有研究者尝试用不同方法对核团进行定点卒中造模，以获得高质量的卒中后抑郁动物模型。内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是由血管内皮细胞产生的活性肽，具有强效的血管收缩功能，最早被广泛用于脑内核团卒中造模研究[6-7]，由21个氨基酸组成，7个疏水性氨基酸分布在表面，在-20℃下，经无菌水溶解的ET-1保存时间较短且易降低生物活性[8-9]。在C57/BL6小鼠的左内侧前额叶皮层多点注射ET-1，于术后第6周发现小鼠产生抑郁样行为，建立了一种全新的卒中后抑郁模型，但该方法多点注射易造成机械性损伤，基于磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)方法的检测成本和人工成本高。为了解决上述问题，本研究通过改良左内侧前额叶皮层卒中后抑郁造模试验方法，并在术中使用无辐射的激光散斑血流成像系统对卒中造模结果辅助性判断，降低手术误差，提高成功率，为更好的建立卒中后抑郁Balb/c小鼠模型、探究卒中后抑郁的发病机制、评估治疗性药物等研究储备关键技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Balb/c小鼠，雄性，8周龄～10周龄，平均体重25 g，SPF饲养条件下，光照与黑暗交替12 h。除行为学试验期间外，其他时间均给予小鼠充足的饮水和饲料。将小鼠随机分为对照组和模型组。

1.1.2 试剂和仪器 ET-1、蔗糖为Sigma公司产品；水合氯醛为国药试剂产品；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)、磷酸缓冲盐溶液为索莱宝公司产品；激光散斑血流成像系统为Moor公司产品；小鼠立体定位仪，瑞沃德公司产品；微量注射器，Hamilton公司产品；动物行为学仪器及分析软件，吉量公司产品。

1.2 方法

1.2.1 左内侧前额叶皮层卒中造模及激光散斑血流成像系统辅助造模 根据文献[6]，将ET-1用灭菌水完全溶解(800 pmol/μL)，为测试ET-1对小鼠左内侧前额叶皮层卒中的有效剂量，分别以400 pmol、1 200 pmol的注射剂量对小鼠进行试验。小鼠术前称重，并使用30 mL/L水合氯醛腹腔注射麻醉(0.25 mL/20 g)，待小鼠进入麻醉状态后，固定至立体定位仪并切开头部皮肤，然后将调整好聚焦的激光散斑血流成像系统移至小鼠头部上方，记录手术前血流情况。

手术期间，小鼠体温保持在37℃±1℃，用微量注射器将ET-1以0.20 μL/min速度注射至左内侧前额叶皮层(AP：+2.0 mm；ML：+0.5 mm；DV：-2.4 mm)，在右内侧前额叶皮层(AP：+2.0 mm；ML：-0.5 mm；DV：-2.4 mm)也进行同样的手术，ET-1换成同体积无菌水，作为假刺激对照，注射完毕后，针管留置10 min。取出针管后，立即将激光散斑血流成像系统移至小鼠头部上方，通过手术前后注射位点的血流变化幅度，判断ET-1对左内侧前额叶皮层是否发生了明显阻断作用，再进行外科缝合闭合切口。手术之后小鼠放置在37℃恒温箱中保持体温直至活动正常，放回原饲养环境。对照组进行同样的手术，ET-1换成同体积灭菌水。

1.2.2 TTC染色 在文献[10]基础上略加修改，ET-1注射后48 h，对小鼠进行麻醉、处死并取出脑组织置于-20℃冷冻10 min。将脑组织，从前往后作冠状位连续切片并浸泡于20 g/L TTC溶液中孵育，待切片变红后，取出切片、拍照，判断卒中区域。

1.2.3 动物行为学测试 行为学测试开始前，将小鼠从动物房移至行为学测试房间2 h以适应环境，其中除悬尾试验需在较强光下进行外，其余试验均在正常光照下进行。

1.2.3.1 蔗糖偏好试验 在文献[11]基础上略加修改，将小鼠单笼饲养，试验前剥夺小鼠饮水24 h，正常采食，每个笼子上装有两个相同规格、瓶塞带有滚珠的水壶。一个壶中装饮用水，另一个壶中装蔗糖溶液。试验从暗周期开始，下一个暗周期前结束。

1.2.3.2 悬尾试验 在文献[12]基础上略加修改，单独将小鼠尾端固定，悬挂于30 cm×30 cm×30 cm敞箱中，距地面15 cm。每只小鼠在测试前务必清除敞箱中粪便及尿液，以免残留气味造成影响。试验全程5 min，用视频记录仪拍摄并储存，用动物行为学视频分析软件截取并分析试验最后4 min内小鼠挣扎时间和不动时间。

1.2.3.3 开场试验 在文献[13]开场试验基础上略加修改，将小鼠单独放置在高50 cm，底部40 cm×40 cm的正方开场中。每只小鼠在测试前务必清除开场中的粪便及尿液，以免残留气味造成影响。将小鼠轻轻地从边缘区域放入开场，试验全程6 min，用视频记录仪拍摄并储存，用动物行为学视频分析软件截取并分析试验最后5 min内小鼠活动轨迹、在中心区域内活动时间和活动总路程。

1.2.4 统计学分析 各组数据均采用均值±标准误(mean±SEM)表示，统计学处理采用GraphPad Prism软件分析，两组间均数用t检验。nsP>0.05即两组无显著差异，*P<0.05即两组差异显著，**P<0.01即两组差异极显著。

2 结果

2.1 左内侧前额叶皮层卒中造模术式

手术时，适当滴加磷酸缓冲盐溶液至颅骨，保持其表面湿润，更利于激光散斑血流成像系统记录血流状态，其手术过程及激光散斑血流成像系统辅助造模见图1A，由左至右分别是小鼠头部固定、立体定位注射、激光散斑血流成像系统记录不同时刻的血流状态。对注射剂量为1 200 pmol的小鼠术后48 h进行TTC染色(图1B)，左侧ET-1注射可导致左内侧前额叶皮层注射位置附近肉眼可见的白色的卒中梗死灶，与右侧无菌水注射点形成鲜明对比。与中央前回TTC染色结果比较，证明其未扩散至其他未注射核团。

A.颅内立体定向微量注射手术及激光散斑血流成像系统血流监测；B.ET-1注射48h后TTC染色图

2.2 激光散斑血流成像系统辅助造模

通过激光散斑血流成像系统，可利用血流散斑流速指数(speckle flow index,SFI)进行非侵入性监测实现对同一小鼠的左右脑手术前后血流变化的观察。左侧为ET-1注射位点，右侧为无菌水注射位点(图2B和图2D)，结合图2A和图2C可发现，在400 pmol注射剂量下，其左侧注射ET-1前后的SFI差值(120)与右侧注射无菌水前后的SFI差值(115)无明显差异，而在1200 pmol注射剂量下，其左侧注射ET-1前后的SFI差值(85)远高于右侧注射无菌水前后的SFI差值(40)。证明当ET-1的注射剂量为1 200 pmol时，可快速、有效地造成左内侧前额叶皮层卒中。在随后试验中，使用该剂量对小鼠进行手术，且每只小鼠注射前后，同样使用激光散斑血流成像系统初步判断卒中过程。

2.3 小鼠行为学变化

为了判断该剂量是否足以引起抑郁样行为，在术后第4周用多种方法来比较对照组和模型组小鼠的行为学差异(图3)。

2.3.1 蔗糖偏好试验结果 通过小鼠对蔗糖溶液和纯净水摄入的比例来衡量小鼠的行为，如果模型小鼠对蔗糖溶液摄入比例小于对照组，则证明模型组小鼠发生了抑郁样行为。本次研究中，模型组小鼠对蔗糖的偏好百分比略低于对照组小鼠，证明模型组小鼠对蔗糖刺激的快感正在慢慢消失(图3A)，具有抑郁样行为倾向。

2.3.2 悬尾试验结果 由于环境压力突发巨变，小鼠往往表现出拼命挣扎试图逃跑的行为以及因无法逃脱而陷入绝望不动的行为，更快放弃挣扎和更早进入绝望不动，则视为小鼠发生了抑郁样行为。本次试验中，模型组小鼠无论在代表试图逃跑的挣扎时间，还是代表绝望无助的不动时间这两个水平上，与对照组小鼠之间均形成了显著差异，证明模型组小鼠比对照组小鼠更易出现绝望状态的抑郁样行为(图3B、3C)。

2.3.3 开场试验结果 因小鼠进入陌生环境有趋利避害的天性，而有抑郁样行为的小鼠在进入陌生的开场环境可表现为对较明亮的中央区域探索能力下降，以及更喜欢在较阴暗的四周活动。结合本次开场试验的小鼠在中心区域内活动时间的统计结果、小鼠运动轨迹图(图3D、3F)可知，模型组小鼠在中央区域的活动时间略有下降，并且偏好在四周及角落活动，证明模型组小鼠具有抑郁样行为的倾向。通过对两组小鼠活动总路程进行统计，结果发现模型组小鼠在开场环境中的总路程显著高于对照组(图3E)，证明模型组小鼠在陌生环境中有焦虑、恐惧的行为是小鼠抑郁样行为的表现之一。

A.400 pmol ET-1注射前后血流变化曲线；B.血流图像；C.1200 pmol ET-1注射前后血流变化曲线；D.血流图像

3 讨论

大脑中动脉缺血再灌注、双侧颈总动脉永久闭塞法等现有动物模型，由于试验操作复杂、卒中面积大、致残/致死率高等不利因素的存在，无法建立稳定的卒中后抑郁模型[14]。通过定点人工诱导脑部功能核团的卒中，可引起抑郁表型，其分子机制可成为发现潜在药物类型及作用靶点的新通路。人工诱导脑部功能核团的卒中造模方法主要有自体血栓卒中法，局部皮质光卒中法和ET-1定点注射卒中法，自体血栓卒中法的卒中部位随机，局部皮质光卒中法的作用部位具有局限性[15]，因此ET-1定点注射卒中法以其强大的ET-1血管收缩能力和准确定点卒中等特点，被更多的研究者用来模拟脑部功能核团的卒中，将ET-1经多点注射至左内侧前额叶皮层建立新的卒中后抑郁动物模型，表明该方法用于卒中后抑郁造模的可行性[16-18]，但在实际操作过程中其重复性、稳定性无法满足当前研究的要求。

A.模型组小鼠的蔗糖消耗百分比略低于对照组(P>0.05)；B～C.模型组挣扎时间非常显著低于对照组(P<0.01)，且不动时间非常显著高于对照组(P<0.01)；D～F.模型组在中央区域的时间略低于对照组(P>0.05)，模型组总路程非常显著低于对照组(P<0.01)，模型组比较对照组更偏好在角落活动

MRI配合TTC染色可对卒中造模结果进行判断[19-20]，但MRI仪器设备昂贵，而且仪器辐射易增加试验者的暴露风险，并不适合在一般实验室开展相关工作。TTC染色只能将小鼠处死后进行染色，无法确定测试小鼠是否确实发生卒中，影响了该模型的广泛应用。

激光散斑血流成像系统通过高分辨率的实时动态血流监测，直观得出所检测区域的微血管血流分布状态和血流变化情况，其优势在于试验动物无需额外服用造影剂、检测速度较快、对试验人员无辐射暴露风险、减少试验成本且符合动物伦理等，逐渐受到国内外比较多实验室的青睐[21-23]。而且作为一种非侵入性血流检测方法，能够有效检测小鼠脑部卒中，适合用于脑卒中模型评估。因此，本研究改良前人的手术方案，通过减少注射位点，增大单一注射位点ET-1注射剂量就可完成左内侧前额叶皮层卒中后抑郁造模。使用激光散斑血流成像系统辅助左内侧前额叶皮层颅内立体定向微量注射手术，观察卒中过程中血流情况变化，成功地造出一批低死亡率、高成功率的卒中后抑郁Balb/c小鼠模型，大大提高了该模型的稳定性，为基于脑部功能核团卒中导致抑郁的发病及神经病理机制研究奠定了基础。