猪α冠状病毒免疫机制及检测技术研究进展

王烁程,张林波

(吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118)

随着我国养猪量的不断增加，猪群中疾病的流行情况也日趋复杂。腹泻是猪群中比较常见的疾病，多发于冬季，主要症状是水样腹泻并伴有呕吐，严重程度随病猪的年龄变化而有差异，年龄越小，症状越严重，如今已成为世界范围内的流行病。对于该病的病原学、免疫学等方面的研究，为该病的预防及检测提供了新的思路。

1 猪α冠状病毒简介

冠状病毒(Coronavirus)是自然界中较为常见一类RNA病毒，能够感染哺乳动物肠道上皮细胞或呼吸道上皮细胞，且具有致命性。冠状病毒最早发现于20世纪60年代，为禽类传染性支气管炎病毒，随后又在人类普通感冒患者的鼻腔中发现人类冠状病毒229E(HCoV-229E)以及人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)。

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)均为α冠状病毒，属于正义单链RNA病毒，基因组包含50个非翻译区和至少7个开放阅读框(open reading frame,ORF)，其中ORF1a和ORF1b占据病毒基因组的2/3，编码2个非结构性复制酶多聚蛋白[1-2]，其余1/3则编码结构蛋白，包括刺突糖蛋白(spike protein，S)，是一种跨膜糖蛋白，从病毒表面突出，其N端胞外域是受体结合位点，且含有主要的抗原决定簇；膜蛋白(membrane protein，M)含有3个跨膜结构域，主要功能是进行营养物质的跨膜运输，并形成病毒外包膜；小包膜蛋白(envelope protein，E)是有离子通道活性的小疏水蛋白，能够与包膜结合；核蛋白(nuclear protein，N)包裹RNA形成核衣壳，并且能够诱导内质网应激，上调白细胞介素的表达。除此以外，少数冠状病毒还含有血凝素酯酶[3-5]。

2014年，在美国俄亥俄州腹泻仔猪的粪便中检测到一种与猪α冠状病毒基因组排列近似的冠状病毒，命名猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)。PDCoV基因组除ORF1a、ORF1a、S、E、N外，还包含辅助蛋白6(accessory protein 6，NS6)、辅助蛋白7(NS7)和辅助蛋白7A(NS7a)。迄今，PDCoV仅在猪中被发现具有传染性[6-7]。

2 猪α冠状病毒感染的受体

病毒侵入宿主细胞起始于病毒与细胞受体的结合。目前认为，PEDV、TGEV等利用氨基肽酶N(aminopeptidase N，APN)作为与细胞结合的受体。APN是一种Ⅱ型细胞膜金属蛋白酶，其存在于细胞表面，通过N端的胞质域与细胞连接，广泛分布于成熟的小肠上皮细胞、小肠微绒毛表面等部位。APN能够作为细胞因子、免疫调节剂、血管作用肽等物质的底物，在降低T细胞对MHCⅡ类分子-抗原肽的识别等方面发挥作用[8-10]。

APN糖基化区域存在动物物种差异，使其具有高度的物种特异性，如人类冠状病毒无法以猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N，pAPN)作为细胞受体；TGEV能够与纯化的pAPN特异性结合，说明pAPN是TGEV的受体[11]。多项研究证明，pAPN在PEDV的感染中也发挥作用：①通过将表达pAPN的基因转染到犬肾细胞(mardin darby canine kidney，MDCK)，使MDCK能够表达pAPN，能够被PEDV感染，且MDCK不是PEDV的易感细胞，说明pAPN能够提升细胞对PEDV感染的敏感性；②采用病毒铺覆蛋白结合试验研究PEDV的受体，鉴定出一种150 ku的蛋白，是小肠上皮细胞和猪睾丸细胞的PEDV受体，使用抗pAPN抑制剂后，该蛋白与PEDV的结合被阻断，说明该受体蛋白是pAPN；③表达pAPN的转基因小鼠能够被PEDV感染；④用pAPN抗体对细胞进行孵育后，接种PEDV时感染受到了干扰。然而近来的很多研究发现，pAPN可能不是PEDV感染的唯一受体：①通过使用外源表达并亲和纯化后的TGEV-S1和PEDV-S1蛋白，以流式细胞术分析两种蛋白与pAPN的结合能力发现，TGEV-S1能够与MDCK表达的pAPN结合而不与亲代MDCK表面结合，但PEDV-S1并不与细胞表达的pAPN结合；②将猪睾丸细胞(swine testis，ST)细胞中的pAPN基因通过CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除后，发现基因敲除后ST细胞依然能够被PEDV感染。此外，HeLa细胞也能够被PEDV感染，但该感染过程并不需要pAPN作为受体[12]；③将猪小肠上皮细胞培养3 d后，pAPN的表达量仅达到了成熟猪小肠上皮细胞的约11%，说明培养3 d的细胞尚未完全成熟，培养7 d后pAPN的表达量有了明显提高，且培养7 d的小肠上皮细胞对TGEV敏感性显著高于培养3 d的，这与病毒主要感染并破坏小肠绒毛内衬的成熟小肠上皮细胞的情况相吻合，而PEDV的感染率却没有因为培养细胞的成熟出现明显变化。通过分析衰老的小肠上皮细胞和经分化因子处理的小肠上皮细胞的pAPN表达量发现，以上两种细胞均能表达较高水平的pAPN，增强其对PEDV感染的敏感性[13-14]。说明pAPN是PEDV感染的受体但并不唯一受体。PEDV是通过顶膜进入小肠上皮细胞的，除pANP外，其他分子在小肠上皮细胞分化过程中也于顶膜表达，如氢化可的松。氢化可的松在脂质、蛋白质等物质的代谢过程中具有重要作用，并且也是内皮细胞分化的关键因素，还能够显著上调人皮肤成纤维细胞中APN的表达，说明其也有可能是PEDV感染的另一受体[15]。

3 猪α冠状病毒感染过程中与细胞免疫相关的重要物质

3.1 真核翻译起始因子4-α

M蛋白是猪α冠状病毒的结构蛋白，在病毒复制过程中具有重要作用，且该蛋白能够用于特异性检测和治疗。M蛋白作为连接因子与高尔基体前区隔中的基因组RNA和核蛋白相互作用来启动病毒颗粒的装配。M蛋白的配体是真核翻译起始因子4-α，将外源表达的GST-EIF4A2融合蛋白添加到含有相同浓度的GST-M蛋白的琼脂糖微珠中，通过免疫共沉淀分析发现，EIF4A2和TGEV-M能够在体外相互作用[16-18]。TGEV感染的细胞，通过间接免疫荧光试验(IFA)发现，EIF4A2分布于细胞质和细胞核中，而M蛋白与EIF4A2在细胞质中出现部分重叠，说明在TGEV感染细胞中，EIF4A2与M蛋白存在相互作用。通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制宿主细胞EIF4A2表达，发现TGEV的复制受到了抑制，说明EIF4A2在TGEV的复制中发挥重要作用，该蛋白的发现有助于开发防控TGEV感染的新型制剂[19-20]。

3.2 胆固醇25-羟化酶和25-羟胆固醇

胆固醇25-羟化酶(cholesterol 25-hydroxylase，CH25H)是一种宿主细胞限制因子，能够催化胆固醇被氧化为25-羟胆固醇(25-hydroxycholesterol，25HC)，而25HC在宿主抑制病毒感染中有重要作用[21]，该蛋白能够抑制固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins ，SREBPs)。通常情况下，SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein，SCAP)与SREBPs在内质网中形成复合体。当合成固醇时，SREBP-SCAP在高尔基体中被位点1蛋白酶和位点2蛋白酶裂解为转录因子；当脂质过剩时，SCAP的构象发生变化，并与胰岛素诱导基因结合(insulin-induced genes ，INSIGs)。25HC通过控制固醇生物合成过程中INSIGs的表达来增加内质网中的SREBP-SCAP复合体的含量[22]。因此，25HC被认为是固醇抑制剂。用构建的pCAGGS-CH25H重组质粒转染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)后，用PEDV感染Vero细胞发现，感染组N蛋白和mRNA表达水平明显低于对照组。通过IFA分析发现，PEDV的复制被抑制，说明CH25H能够抑制PEDV感染，且即使在CH25H酶活性较低的情况下，依然能够抑制PEDV的复制。当用siRNA抑制CH25H表达时，PEDV N蛋白和mRNA表达水平都有所增加，通过测定TCID50发现，敲低CH25H会显著提高病毒滴度，说明25HC和CH25H均对PEDV感染有抑制作用，且抑制作用呈剂量依赖性。对感染YZ、MS、CV777、SH等4种PEDV毒株的Vero细胞使用25HC发现，25HC对4种毒株的复制均有抑制作用，说明25HC对PEDV的抑制具有广谱性[23-24]。然而，25HC对抗PEDV感染的机制尚不明确，推测其可能是通过阻断病毒进入宿主细胞的方式来抑制PEDV感染，并且对TGEV和PEDV感染均具有抑制作用。

4 猪α冠状病毒的免疫逃逸机制

干扰素(IFN)介导的抗病毒反应是病毒与宿主相互作用的重要组成部分，在抗感染过程中发挥重要作用[25]。通常病毒侵入宿主细胞后，细胞的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR) 首先对其进行识别，而后诱导抗病毒反应，PRR的主要成分是维甲酸诱导基因-1样受体，包括遗传学和生理学实验室蛋白2、黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation associated gene 5 ，MDA5)和维甲酸诱导基因-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ)。正常生理状态下，RIG-Ⅰ通过N端的Caspase激活募集结构域与线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein ，MAVS)相互作用，处于自抑制状态。RNA病毒感染后，产生的干扰素激活RIG-Ⅰ和MDA5。环指蛋白135通过K63蛋白释放出RIG-Ⅰ自抑制所必须的E3连接酶，而MDA5通过CARD和MAVS的相互作用激活干扰素信号转导途径。在此过程中，MAVS激活丝氨酸激酶1(TANK binding kinase 1，TBK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2 ，TRAF2)，TRAF3，TRAF5和TRAF6。而后通过干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)和核转录因子κB(NF-κB)使TBK1进入细胞核，通过相应的信号转导途径产生包括IFN-β在内的主要抗病毒因子[25-26]。目前认为，不同冠状病毒的N蛋白作为拮抗剂，通过靶向不同的信号蛋白介导RLR信号通路。如PEDV的N蛋白能够螯合HEK293T细胞中TBK1-IRF3复合物，从而抑制IFN-β和核转录因子κB的活化。PDCoV的N蛋白也能够抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β产生。PDCoV N蛋白可以直接靶向RIG-Ⅰ，并通过干扰K63阻断其早期活化[27-28]。除N蛋白外，PDCoV的辅助蛋白NS6也是IFN-β的拮抗剂[29]。说明PDCoV N蛋白的作用机制与其他冠状病毒不同，也说明了N蛋白在冠状病毒感染、免疫逃逸等方面具有重要作用。

除了N蛋白外，PEDV的核酸核糖内切酶(endoribonuclease ，EndoU)在逃避宿主巨噬细胞先天免疫中可能发挥关键作用。用构建的PEDV EndoU缺陷病毒株感染PK1细胞和巨噬细胞发现，缺陷型PEDV感染PK1细胞和巨噬细胞的IFN水平均高于野生型，由于PK细胞主要分泌Ⅲ型IFN，巨噬细胞主要分泌Ⅰ型IFN，由此推断EndoU能够减轻机体的Ⅰ型和Ⅲ型IFN的应答，从而逃避宿主的先天免疫防御[30-31]。除PEDV外，其他冠状病毒，如严重急性呼吸综合症病毒(SARS-CoV)也表达EndoU，说明EndoU在研究冠状病毒的免疫逃逸及设计新型减毒活疫苗方面有重要意义[32]。

5 猪α冠状病毒检测新技术研究

对于猪冠状病毒的检测方法，目前研究十分广泛，如RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、荧光RT-PCR方法、环介导等温扩增以及适用于大批量样品检测的双抗夹心ELISA方法等[33-34]，以上方法是利用引物来扩增病毒核酸或通过外源表达病毒蛋白来检测相应病毒抗体的传统方法。除常用方法外，生物芯片、实时动态细胞成像等新型技术也不断被用于猪冠状病毒的检测，显著提高了检出效率。

5.1 蛋白质芯片技术

蛋白质芯片技术是以NC膜作为载体，结合可视化显色技术的可视化蛋白芯片。蛋白质芯片技术是对常规ELISA方法的扩展，因为N蛋白在猪α冠状病毒免疫逃逸方面的重要作用，通常采用外源表达方式获取N蛋白作为检测用的抗原蛋白，来检测待测血清中的相应抗体，其优点在于成品芯片在操作方面的便利。然而，以抗原抗体特异性反应为基础的检测手段受个体差异及免疫逃逸等因素的影响，在检测准确率方面尚不及高通量成像技术。除N蛋白外，其他蛋白在猪冠状病毒检测中也有应用，通过外源表达S、M、N、E蛋白来检测PEDV抗体发现，表达的S、M、N蛋白均能与抗体发生反应，而抗体的应答强度取决于抗原含量，S蛋白构成了病毒表面的日冕状突起，M蛋白是病毒体膜中的主要蛋白，N蛋白是病毒感染过程中的主要蛋白，而E蛋白仅少量存在于病毒包膜中，以蛋白作为抗原进行免疫反应检测的强度与该蛋白在病毒中的含量情况相吻合，即含量越高，反应越灵敏。N蛋白的N端存在PEDV、TGEV等冠状病毒相同的抗原表位[35]，以N蛋白作为检测抗原可能会出现交叉反应，在猪冠状病毒的免疫学检测中，S、M蛋白具有更大的价值，这一方面尚待深入研究。

5.2 高通量实时动态细胞成像及功能分析技术

高通量实时动态细胞成像及功能分析技术与高通量细胞成像分析系统，被用于猪冠状病毒的检测。该方法是将热灭活的待测血清样本在MEM培养基中用含有蛋白酶抑制剂的胰蛋白酶进行稀释，而后将血清样本与PEDV等比例混合并孵育，再将混合物添加到含有Vero细胞的96孔板中进行孵育后与异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体进行反应，然后在高通量成像细胞仪上以541 nm读取数据，通过与阴性对照对比，来判定是否为猪冠状病毒感染[36]。该方法利用检测中和抗体的细胞成像技术，具有可视化和计量细胞的优点。在检测过程中，使用高通量成像细胞仪进行读取并评估结果，客观的数据读取方案和计算方法消除了人为操作的主观性，且读取时间不超过4 min。细胞成像术提供了一种客观且快速的检测方法。

6 展望

猪流行性腹泻于20世纪70年代被发现，是由猪α冠状病毒引起的传染病，对养殖业造成巨大危害，其感染相关受体和免疫逃逸机制的研究为相关疫苗和检测技术的研发提供了重要依据。近年来，对于病毒功能性受体的研究已成为病毒相关研究的重要内容。随着相关研究的不断深入，相信不久的将来由冠状病毒引起的疾病一定会得到有效控制。