苦参碱类生物碱提取工艺优化及纯化方法

拉巴次旦，纪 鹏，赵年寿，吴金措姆*，马兴斌，四朗玉珍，班旦，格桑卓嘎

(1.西藏自治区农科院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

苦参碱类生物碱广泛存在于豆科槐属药用植物中，如苦参、苦豆子、山豆根和砂生槐；苦参碱类生物碱中的单体成分主要有氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和槐定碱等成分，这些成分具有广泛的生物活性，如抗病毒、抗寄生虫、消炎、抑菌、调节中枢神经、调节心血管机能等[1]，因此具有较好的兽药应用开发前景。 为筛选出苦参碱类生物碱成分的高效提取纯化方案，本文主要对苦参碱类生物碱成分的提取方法、工艺优化及纯化方法的相关研究进行了回顾分析，为获取高提取量和高纯度的苦参碱类生物碱的研究提供参考。

1 苦参碱类生物碱的提取方法

传统生物碱的提取方法主要有水提、醇提、酸水提、浸渍、渗漉、煎煮和回流提取法，这些方法获取生物碱含量较低且纯度不高；通过对苦参碱类生物碱提取技术的深入研究，超声辅助提取、微波辅助提取、双水相萃取、加速溶剂、分子印迹技术、高效液相色谱等方法应用而生，因其便捷、高效、快速等优势，在苦参类生物碱的提取分离过程中得到了更加广泛的应用[2]；为了能更加有效的利用苦参碱类生物碱成分的利用度及经济价值，现对苦参碱类生物碱提取方法进行梳理。

1.1 超声波辅助提取法

超声波辅助提取法主要通过机械效应和热效应使中药中的成分更有利于溶解和释放。运用超声波辅助提取方法能节省时间、降低成本、获取高提取率等优点，优于与非超声的传统水提方法，使苦参碱提取率从0.213%提高到0.472%，说明该方法能显著提高生物碱的提取率。

1.2 双水相萃取法

双水相萃取法是一种易于放大、可连续化操作的液/液萃取分离技术，在天然产物分离纯化领域应用较多。用乙醇/硫酸铵构建双水相体系，能更加稳定、获得的萃取率更高。用该方法能获取更多的苦参碱类生物碱含量，适合大规模提取苦参碱类生物碱。

1.3 微波辅助提取法

微波辅助提取法因其工艺简便、受热均匀等特点，应用较为广泛。用密闭微波辅助、聚焦微波辅助、微波辐射-溶剂回流提取法对氧化苦参碱和苦参碱含量的影响进行考察，发现微波辅助提取法比常规回流提取法有更高的提取效率，在作用时间和强度上有明显优势；用冷浸、加热回流、超声提取、密闭微波辅助提取法研究对苦参生物碱的影响，发现密闭微波辅助提取法效果最好，获取氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱的含量分别为12.527、1.422、1.083、4.163、0.758 mg/g。比回流提取法及其他传统提取法的提取效率更高。

1.4 超声波-微波协同萃取法

超声波-微波协同萃取法是一种微波与超声波协同的提取技术，能够实现两者的优势互补，但是目前应用较少。用该方法提取苦豆子中的氧化苦参碱，发现在超声提取条件下，以700 mL/L乙醇为提取溶剂、提取时间3 min、微波功率500 W、固液比1 g/mL∶15 g/mL时，可获得更高的得率，其优势在于能比常压回流提取法和其他单独辅助提取法的提取率增加24.5%[3]。现代提取方法的建立，在一定程度上能极大的节省提取时间，提高生物碱的提取率，尤其是以超声波-微波协同萃取法的提取效率最为显著。

2 苦参碱类生物碱的提取工艺优化2.1 正交试验设计工艺优化

2.1.1 超声波辅助提取正交优化 以超声波温度、提取时间、超声波频率、超声次数为变量，苦参碱、氧化苦参碱、苦参总碱为指标，结合L9(34)正交设计试验进行优化，得到最佳优化条件为：超声频率35 kHz、温度50℃、提取时间32 min、提取次数为1次，可得到苦参碱和氧化苦参碱3.40%和2.71%[4]；采用单因素结合正交试验设计，得到最佳优化条件为：650 mL/L乙醇、料液比1∶20、超声功率40%、提取温度30℃，得到生物碱含量为0.104 mmol/g[5]；结合L9(34)正交设计试验得到优化条件为：粒径60目、650 mL/L乙醇、料液比1∶5、提取时间2 h[6];650 mL/L乙醇，料液比1∶16，温度30℃，提取次数2次，提取时间20 min，提取率4.60%。以超声波辅助为提取方法进行的正交设计优化中，主要考察超声频率/功率、提取时间和温度对生物碱提取量的影响，用优化后的条件提取，能获取更多的生物碱。

2.1.2 乙醇溶剂提取正交优化 结合正交设计试验进行优化，选取最佳工艺条件为：粒径60目，15倍量700 mL/L乙醇，60℃加热提取2次，每次提取1 h，该条件下得到氧化苦参碱、苦参碱、槐定碱和槐果碱含量分别为80.10、19.60、9.26、3.92 μg/g[7]；以超声波提取法研究乙醇、料液比、提取时间和次数单因素对生物碱含量的影响，结合L9(34)正交设计试验进行优化，结果表明，单因素中以乙醇浓度影响最显著，最终优化条件为：400 mL/L乙醇、料液比1∶20、提取时间1.5 h、提取2次，该条件下获取总生物碱16.71 mg/g；通过溶剂HCl(10 mL/L)、乙醇(300、600、900 mL/L)对苦参的氧化苦参碱和苦参碱的含量进行测定，筛选出最佳提取溶剂为600 mL/L乙醇，进一步以料液比、提取时间和次数为考察因素，结合L9(34)正交试验优化氧化苦参碱和苦参碱含量，得到最佳优化条件为：600 mL/L乙醇提取3次，加醇量为12、10、10倍，每次提取2 h；以650 mL/L乙醇作为提取溶剂，考察了料液比、浸泡时间、渗漉速度、粒度因素对6个地区苦参中的氧化苦参碱和苦参碱含量的影响，并结合L9(34)正交优化试验进行优化，得到最佳提取工艺条件为：粒度为粗粉、料液比1∶6、浸泡时间24 h、渗漉速度4 mL/min，得到最佳提取方法为渗漉法，其次为回流法[8]；为了进一步优化苦参叶中生物碱的提取工艺，考察变量乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间、提取次数对生物碱含量的影响，结合正交试验设计，在90℃水浴，料液比1∶25， 800 mL/L乙醇回流提取1次，提取时间2 h的条件下，获得的苦参碱含量最高；由上述内容可知，以乙醇作为提取溶剂的正交设计优化中，乙醇的浓度变化将直接影响生物碱含量的提取率，因此能否选择适宜的乙醇浓度尤为关键，通过上述内容可知，乙醇浓度最适的选择范围在400 mL/L～700 mL/L时，此时获取的生物碱含量较高[9]。

2.1.3 酸水溶剂提取正交优化 以酸水作为提取溶剂结合正交设计优化提取工艺的研究较少，以醋酸水为提取溶剂，以浸膏和苦参碱为评价指标，结合正交试验设计优化，考察酸水浓度、料液比、提取时间、提取次数对生物碱含量影响，得到最佳提取工艺条件为：料液比为药材的6倍量、20 mL/L酸水、提取2次、回流时间1 h，该条件下苦参碱浸膏率最高[10]。

2.1.4 快速溶剂萃取正交优化 为了优化山豆根中苦参碱和氧化苦参碱的最佳提取条件，对温浸、超声、回流、快速溶剂萃取方法进行考察，得出快速溶剂萃取法为获取苦参碱和氧化苦参碱的最佳方法，进一步考察乙醇浓度、提取温度、提取时间、提取次数对生物碱含量的影响，结合L9(34)正交设计试验对快速溶剂萃取法进行优化，得到最佳条件为：乙醇浓度400 mL/L、温度90℃、提取时间13 min、提取次数2次。快速溶剂萃取法作为一种新的提取方法，与其他提取方法相比较，具有显著优势，如提取成本低、省时、高效等。

2.1.5 乳膏剂制备及乳膏剂基质正交优化 正交设计作为一种线性模型优化设计方法，可以筛选出不同因素水平的最佳组合，但其只能分析离散型数据。在正交设计试验优化提取工艺中，提取溶剂主要以乙醇为主，提取方法主要以超声波提取为主，通过对正交设计试验中的溶剂浓度、粒径大小、料液比、提取时间和温度等因素进行考察，发现乙醇的浓度变化能直接决定生物碱的含量，用正交设计试验能有效筛选出不同因素水平之间的最佳组合，进一步提高了苦参碱类生物碱的提取率[11]。

2.2 响应面优化

2.2.1 乙醇溶剂响应面优化 有研究检测了乙醇、料液比、超声时间对苦豆子生物碱含量的影响，结合响应面优化设计，得到最佳优化条件为：650 mL/L乙醇、料液比1∶8、提取时间30 min，该条件下得到生物碱29.1 mg/g[12]；从超声、回流和水提法中筛选出以乙醇为溶剂的回流提取法提取生物碱，每次提取2次，并以乙醇、料液比、提取时间为变量，将氧化苦参碱、苦参碱、总生物碱和浸膏率“归一值”为指标，结合响应面进行优化设计，得到最佳优化条件为：650 mL/L乙醇、料液比1∶10、提取时间2 h，该条件下得到氧化苦参碱、苦参碱、总生物碱和浸膏率的含量分别为0.914%、0.228%、1.719%和16.73%[13]；粒径大小、料液比、提取时间、乙醇浓度对总生物碱的影响，结合响应面法优化提取工艺，得到最佳优化提取条件为：粒径50 目、料液比1∶18.85、提取时间1 h、乙醇浓度88.9%，该条件下得到总生物碱12.59 mg/g[14]；以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数为单因素，以氧化苦参碱、苦参碱和干膏率为指标，结合星点设计效应面法对苦参碱提取工艺进行优化，最终得到最佳优化条件为：650 mL/L乙醇、料液比1∶11、提取次数2次、提取时间65 min。在响应面优化设计中，多选用乙醇作为提取溶剂，考察乙醇浓度、料液比、提取时间变量对生物碱含量的影响为主，从最佳的提取条件中可知，该方法虽然能获取较高含量的生物碱，但是还需要解决提取时间较长和耗材较高等问题。

2.2.2 盐酸溶剂响应面优化 以盐酸作为提取溶剂结合响应面分析，开展提取工艺优化的研究较少，6 mL/L盐酸、料液比1∶16、超声功率300 W、提取时间33 min，该条件下获得生物碱3.72%。响应面设计最多选用乙醇作为提取溶剂，提取方法中主要以超声法为主。响应面分析法采用非线性模型设计，依托高精度的回归方程来进行筛选，可以筛选出不同因素水平的最佳组合，因此能更进一步提高苦参碱类生物碱的提取率。

2.3 双水相萃取工艺优化

乙醇380 mL/L、硫酸铵180 g/L、pH7.0、萃取温度30℃、萃取时间15 min，该条件下得到氧化苦参碱和苦参碱含量分别为96.17%和95.74%。有研究建立了微波辅助双水相萃取法对山豆根的生物碱进行分离，研究粒径、料液比、萃取温度、萃取时间对生物碱提取量的影响，结合响应面法进行优化设计，得到最佳优化条件为：粒径100目，料液比1∶75，萃取温度90℃，萃取时间5 min[15]。通过将双水相萃取工艺与超声辅助相结合的方法不仅有利于生物碱含量的提取，更能极大的缩短提取时间。

2.4 方法筛选工艺优化

麸炒品得到生物总碱含量最高为0.395 5 mg/g，酒炙品次之为0.343 8 mg/g[16]；用水-酸水煎煮、乙醇-碱性乙醇回流、乙醇-碱性氯仿超声提取法对苦参总生物碱含量检测，结果表明，碱性氯仿超声提取法为提取生物碱的最佳方法，该方法获得总生物碱24.29 mg/g，其次为乙醇回流提取法(23.58 mg/g)[17]。麸炒炮制后可以提高生物碱含量，碱性氯仿超声提取、吸附澄清法能在一定程度上获得更高的苦参碱类生物碱含量。

3 苦参碱类生物碱的常见纯化方法

3.1 大孔吸附树脂纯化

大孔吸附树脂纯化的原理是依靠范德华力吸附有机物，或依靠氢键形成半化学吸附，兼具分子筛效果，最终对有机物进行选择性吸附，不受无机盐干扰。苦参碱类生物碱属于吡啶类生物碱，常用的树脂填充物为H103、AB-8、SP825、X-5等。结合响应面法对X-5型大孔树脂的吸附参数进行优化设计，发现在上柱流速为1.65 BV/h、pH为11.30、NaCl浓度2.45 mol/L条件下，得到苦参生物碱动态吸附量实测值为8.29 mg/mL[18]；非极性树脂BS-67-3的洗脱效果最佳，吸附率高达97.36，以吸附液pH为9、乙醇洗脱液浓度为2.0 mg/mL～2.5 mg/mL、氯化钠样品浓度为1.0 mol/L、树脂重量与样品体积比为1∶3、以3倍样品体积的300 mL/L乙醇洗脱，再用3倍样品体积700 mL/L乙醇洗脱后得到生物碱的提取率为97%，纯度高达60%以上[19]；用D101型大树脂，以上样质量浓度0.8 g/mL、上样流速2 BV/h、700 mL/L乙醇洗脱剂、4 BV/h流速进行洗脱，最终获得的总生物碱纯度高达66.83%[20]。由此可见，采用大孔树脂对生物碱的纯度进行处理后能有效的提高生物碱纯度，也是目前生物碱纯化应用较为广泛的方法之一。

3.2 分子印迹技术

有研究建立了能够快速进行同步提取、分离和鉴定砂生槐生物碱的双模板分子印迹固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(MISPE-HPLC-MS/MS)法，能得到氧化苦参碱3 793.88 μg/g和苦参碱含量1 828.25 μg/g[21]。制备热敏型MT分子印迹聚合物，用于分离苦参碱，可显著提高苦参碱的特异性吸附及提取效率[22]。分子印迹技术是集高分子化学、材料科学、生物化学等多学科的一种新型中药活性成分纯化技术，具有预定性和特异识别性的优点。

4 结论

豆科槐属植物中含有丰富的苦参碱类生物碱，这些生物碱成分具有广阔的兽药或兽用饲料添加剂开发前景，但目前针对苦参碱类生物碱的提取和纯化的研究仍缺乏系统性，难以将其大规模的应用到实际的生产应用过程中。因此，在后期研究中，将会进一步对苦参碱类生物碱的提取工艺和提纯工艺进行更深入的研究，以便获得更高效的苦参碱类生物碱提纯方案，为兽药或兽用饲料添加剂开发奠定基础。