miRNA在阿尔茨海默病中的研究进展

李雪娇 郎咸圣婕 张宪亮

(山东大学体育学院，山东 济南 250061)

阿尔茨海默病(AD)是一种多发于老年时期的慢性神经系统疾病，临床特征为学习、记忆和认知功能下降，病理特征为海马体萎缩、β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块积聚和神经纤维缠结〔1〕。miRNA是一类长度约有22个核苷酸的微小RNA。多项研究证明，miRNA在脑学习记忆及认知功能的调控中起重要作用，部分miRNA的异常表达及其介导的下游细胞信号通路与多种AD的病理机制密切相关〔2〕，而以miRNA为靶点的反义miRNA在AD治疗中前景广阔〔3〕。本文对miRNA在AD中的作用机制进行综述。

1 miRNA的产生及作用机制

miRNA是一种内源性的非编码RNA(ncRNA)，在中枢神经系统中广泛分布，对神经发育、分化、成熟发挥重要的调节作用。在细胞核内，编码miRNA的基因首先在RNA聚合酶(Pol)Ⅱ的作用下被转录成前体转录体Pri-miRNA，然后被Drosha酶等加工成前体Pre-miRNA〔4〕。输出蛋白(Exportin)-5将Pre-miRNA运到细胞质，在Dicer酶的作用下形成双链的miRNA配对分子。随后双链分解成单链，一条为随从链(passenger strand)，一条为导向链(guide strand)。单链进入核糖蛋白复合体miRNP(RISC)，并在其作用下形成成熟的miRNA。miRNA与靶向mRNA的3′UTR互补配对，抑制翻译或者翻译后水平表达。如果miRNA与mRNA高度互补配对，使mRNA裂解，若匹配度不高则抑制靶mRNA的翻译〔5〕；导致相关蛋白质无法合成或者合成减少，从而调控基因的表达。哺乳动物基因更加复杂，所以大多是抑制基因表达而非降解。此外，还发现少数miRNA可与5′UTR互补配对裂解靶mRNA或抑制其翻译〔6，7〕。

2 miRNA在AD中的作用机制

AD的发病机制尚不十分明确，目前被广泛认可的主流是Aβ学说和Tau蛋白学说，此外，AD还与神经发生、细胞凋亡、细胞周期再入及炎症反应有关。这些作用机制与miRNA的调控密不可分。

2.1miRNA与神经发生 成年神经发生是指成年大脑中神经干细胞(NSC)通过增殖产生新生神经元并迁移至功能区，不断分化成熟，并整合到神经环路中形成具有功能活性神经元的过程，主要包括神经元增殖、迁移、分化、成熟、存活等过程。其中，海马齿状回颗粒下区(SGZ)和侧脑室室下区(SVZ)的神经发生对维持正常学习记忆至关重要。但在AD中，SGZ和SVZ的神经发生均有一定程度的损害〔8〕，而运动可通过促进成年海马神经发生改善AD小鼠认知功能，提示神经发生的损害在AD的发生发展中起关键作用。

研究已证实，神经发生的不同阶段存在大量miRNA的差异性表达，它们与转录因子及染色质修饰物之间构成复杂的调节网络，在神经发生的不同阶段发挥不同的作用。甲基化结合蛋白(MBD)1是一种甲基化CpG结合域蛋白，参与调控细胞生长发育。研究发现，MBD1能调节成年神经发生，miR-184过表达会使MBD1缺失从而提高NSC增殖，降低NSC分化〔9，10〕；而抑制miR-184表达可缓解MBD1 缺失引起的NSC过度分化〔10〕。进一步研究发现，MBD1与miR-184间的调控是相互的，MBD1可通过调控miR-184与膜相关蛋白Numb1 mRNA的3′UTR结合抑制其翻译，从而调控神经干细胞分化〔9〕；而增加Numb1表达可缓解过表达miR-184诱导的神经元损伤。提示miR-184作为MBD1、miR-184与Numb1调节网络的中心环节，可调控NSC增殖分化间的动态平衡。miR-124特异性表达于成年神经细胞中，在成年SVZ NSC分化中起了关键作用。敲除miR-124可维持SVZ NSC处于正在分裂的神经前体细胞阶段，而过度表达miR-124会诱发神经元早熟，提示miR-124可调控NSC在过度扩增细胞和神经母细胞之间转化。转录因子性别决定基因盒(Sox)-9通过Notch信号通路调控神经祖细胞向胶质细胞分化，而miR-124可通过抑制Sox9表达，诱导NSC向神经元分化〔11〕。因此，miR-124诱导的Sox9表达对SVZ NSCs向神经元谱系分化至关重要。miR-137在成体神经细胞中特异性表达，参与神经元成熟过程。过表达miR-137抑制大脑和初级神经元的树突形态及其表型成熟，而抑制miR-137结果则相反〔12〕。进一步研究表明，miR-137通过抑制Ech2(一种组蛋白甲基转移酶和PcG蛋白)翻译，减少成年SGZ NSC中H3K27me3水平〔13〕。此外，miR-137受到甲基CPG结合蛋白(MeCP)2和Sox2的表观遗传调控〔14〕。提示miR-137、MeCP和PcG可能形成了一个交互闭环，在特定的基因域调控H3K27me2水平，从而影响基因表达。与miR-137相反，miR-132通过抑制核受体相关蛋白1〔15〕和抑制因子元件-1〔16〕的转录后表达，促进树突发生、突触整合和新生神经元存活〔17〕。

2.2miRNA与神经细胞凋亡 细胞凋亡是AD中神经元的死亡形式，细胞凋亡的发生可被抗凋亡因子(Bcl-2、Bcl-w和Mcl-1)和促凋亡因子(Bax、Bak-1和Puma)调控。miRNA可调节抗凋亡因子。在AD转基因小鼠脑内，Bcl-2表达下调，同时伴随miR-34a的高表达〔18〕，进一步研究证实miR-34a可负调控Bcl-2表达，诱导细胞凋亡，加剧神经元丢失〔19〕。除miR-34a之外，miR-15b、miR-29a、miR-181a/c和miR-210也对Bcl-2起调节作用。在AD中，miR-125b和miR-422上调，Bcl-w表达下降，细胞凋亡增加〔20〕。此外，miR-153和miR-181a/c可靶向作用于另一种抗凋亡因子Mcl-1〔21〕，抑制细胞凋亡；而下调miR-512，可诱导Mcl-1分泌增加，从而改善AD〔22〕。miRNA调节促凋亡因子。研究发现，在神经元或星形胶质细胞中，miR-29a/b、miR-125b可抑制Puma和Bak-1，抑制细胞凋亡〔23〕。上调miR-23a和miR-27a会通过抑制Bax和Puma起神经保护作用，而下调会造成急性缺血条件下的脑损伤〔24〕。

2.3miRNA与细胞周期再入 正常情况下，成年神经元平时处于休眠状态，而在DNA受损超过其修复能力时，细胞周期蛋白(cyclin)异常表达，驱使细胞周期异常启动，这些被迫重新启动的神经元进入细胞周期后并不能继续分化，而是走向死亡。研究发现，在AD脑内，p53表达增加，促使细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4磷酸化，磷酸化的CDK4可磷酸化视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白，使其与E2F1蛋白解离，后者驱动细胞周期再入。AD中受损神经元重新进入细胞周期(细胞周期再入)已成为AD早期主要病例特征之一〔25〕。

目前，与AD脑内细胞周期再入相关的miRNA包括miR-26b、miR-34a、miR-106b等。其中，miR-26b可促进编码RbmRNA的翻译〔26〕，驱使AD脑内细胞周期再入；而抑制miR-26b可抑制细胞周期再入，缓解AD神经元受损。miR-34a可通过抑制Cyclin D1进而抑制淀粉样前体蛋白(APP)/早老素(PS)-1小鼠脑内的细胞周期再入〔27〕。此外，有研究发现AD脑内miR-106b表达增加，神经元重新进入细胞周期〔28〕，提示抑制miR-106也可抑制细胞周期再入，但目前并不清楚miR-106作用的目标蛋白。

2.4miRNA与神经炎症反应 神经炎症在AD病理生理学中有重要作用，有证据表明，来自外周的星形胶质细胞、小胶质细胞(MG)和免疫细胞参与AD中神经炎症和神经变性的过程。其中，MG是中枢神经系统免疫的主要组成部分，当它处于静止状态时有助于神经保护。研究证实，miRNA介导的神经炎症反应可能与AD发病机制有关。miR-146a是一种高度诱导型miRNA，与炎症机制有关。AD中miR-146a表达升高，高表达的miR-146a可促进核因子(NF)-κB介导的促炎因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α的分泌〔29〕。此外，miR-9、miR-34a、miR-125b和miR-155，也通过NF-κB介导TNF-α、IL-1β及集落刺激因子(CSF)上调，诱导AD发生。提示部分miRNA可负调节NF-κB，介导神经炎性反应。另外，Toll样受体(TLR)4作为NF-κB的上游通路，可被miR-181c 激活，从而减少NF-κB介导的炎症〔30〕。此外，正常情况下miR-124可使MG维持在静止状态，AD中miR-124表达下调，促使转录因子C/EBP-α表达，激活M1型MG，抑制M2型MG，阻止损伤的神经进行修复，致使AD进程不断加剧〔31〕。

2.5miRNA与Tau过度磷酸化 Tau蛋白是一种可溶性的蛋白质，由位于17号染色体上的MAPT基因编码，在脑部神经元中表达丰富，有稳定神经元微管的作用。当Tau表达异常时就会引发神经系统疾病。Tau蛋白过度磷酸化由体内的蛋白激酶引起，根据作用位点可分为两类，一类是作用于脯氨酸的激酶，如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、CDK5；另一类是非作用于脯氨酸的蛋白激酶，如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。miRNA可通过调节激酶参与Tau蛋白的磷酸化过程。

CDK5在大脑正常发育中不可或缺，其与p35蛋白结合后被激活，促进tau蛋白过度磷酸化。miR-107可通过调节p35表达，间接上调CDK5水平，从而促进tau蛋白过度磷酸化。此外，miR-125b也可直接促使CDK5表达上调，促进tau蛋白过度磷酸化〔32，33〕。GSK-3β是一种色氨酸/苏氨酸激酶，可过度磷酸化tau，降低其对微管的稳定作用。作为miR-26a的下游基因，miR-26a通过激活Wnt信号通路磷酸化GSK-3β，从而促进tau过磷酸化。与miR-26a功能相反，miR-153表达增加可下调GSK-3β水平，减少tau蛋白磷酸化〔34〕，减缓AD。细胞外信号调节激酶(ERK)是MAPK 3条信号通路之一。在AD中，miR-132可下调ERK信号通路，促使tau蛋白过度磷酸化〔35〕。此外，miR-124和miR-132也可通过调节Tau蛋白外显子10的剪接过程，直接调控tau蛋白表达〔36〕。

2.6microRNA与Aβ沉积 Aβ是β-APP在β-分泌酶(主要是BACE1)、γ-分泌酶(主要是PS-1)连续作用下分解产生的多肽片段。正常情况下，Aβ生成和清除处于动态平衡状态，而当Aβ生成和清除出现异常时，其缓慢沉积可形成老年斑，产生神经毒性效应。miRNA可通过调节Aβ生成和清除相关基因的表达，调控Aβ沉积。

2.6.1miRNA调节Aβ生成 miRNA可通过调控或负调控APP、BACE1、PS-1基因调节Aβ生成。miRNA可调节APP的合成、剪接和胞吞作用。miR-124表达下调会促进多聚嘧啶区结合蛋白(PTBP)1和PTBP2，而PTBP1控制前体APP的剪接，促进产生的APP异构体中含有外显子7和8〔37〕；已有研究表明在AD患者脑中外显子7和8随着异构体的增加而增多〔38〕。miR-20a可与编码APP的mRNA的3′UTR结合，导致前体APP产生受限，影响Aβ的产生；在人体Hela细胞和大鼠海马神经元中，发现miR-101与miR-20a功能相同。miR-153下调会抑制同源旁系的淀粉样肽前体蛋白(APLP)2基因，后者参与APP的功能表达，异常的APLP2加工会导致APP的错误定位〔39〕。在Aβ的生成过程中，胆固醇可促进APP和BACE1移位到脂筏，通过胞吞作用加速APP加工成Aβ，miR-181c、miR-137的下调与之相关〔40〕。此外，miR-17p、miR-106a、miR-137等也可通过调控APP蛋白表达，参与调控脑内Aβ沉积〔41〕。

研究发现，下调miR-106b导致了BACE1表达增多，驱动APP向Aβ水解途径转移，促进Aβ生成增多〔42〕。miR-124除了可调控APP之外，还可靶向负调控BACE1，抑制Aβ42的产生〔43〕。miR-107是一种在AD早期表达减少的miRNA，可负调控BACE1，调控Aβ沉积〔44〕。此外，miR-29分为miR-29a、miR-29b-1和miR-29c多个亚型，三者的过度表达均可降低内源性BACE1的水平，抑制Aβ的产生，减缓AD。PS-1是γ-分泌酶参与Aβ生成的重要催化剂之一，在PS-1敲除小鼠中，miR-9表达下调，提示miR-9可靶向于PS-1基因，调控Aβ沉积。在γ-分泌酶参与Aβ生成的过程中miR-138发挥了重要作用，它可以通过抑制RARα干扰ERK-1，调节γ-分泌酶水解C99片段，促进Aβ毒性肽的产生〔45〕。同时在APP/PS-1转基因小鼠也发现了miR-9表达显著下调，且发现miR-9的下调也与APP功能障碍有关〔46〕。提示miR-9可以靶向于APP和PS-1基因，调控APP和PS-1的表达。miRNA可以调控前体APP、APP、PS-1、BACE1等Aβ生成相关蛋白，然而这种调控并不是单一发挥作用的，它们之间相互联系，多个或者同时被miRNA调控，从而影响Aβ的生成过程。

2.6.2miRNA调节Aβ清除 APP C-末端片段AICD可诱导神经元释放金属内肽酶(MMEP)、脑啡肽酶(NEP)、胰岛素降解酶(IDE)，促进Aβ42降解。然而，目前尚不清楚miRNA如何调节Aβ降解酶。低密度脂蛋白相关受体(LRP)1和LRP2等可控制血脑屏障(BBB)的通透性从而控制Aβ42进入大脑循环〔47〕。灵长类动物实验发现miR-603使LRP1表达上调，加速Aβ42的清除〔48〕。miR-146a可直接靶向LRP2，加速脑内Aβ42的清除〔49〕。在BBB的人内皮细胞模型中，miR-107表达下调，BBB的完整性被破坏。实际上，miR-107表达下调促进BBB通透性调节剂Endophilin-1表达，促使紧密连接蛋白再合成，抑制了BBB的完整性恢复，从而减慢清除速率〔50〕。此外，缺氧小鼠和人脑微血管内皮细胞实验证实miR-132/212的过表达也会破坏BBB的完整性〔51〕。最近研究发现，在脑缺血再灌注的大鼠实验中，miR-21通过MAPK信号通路，抑制了大鼠血脑屏障损伤〔52〕，但是否与Aβ清除有关还需进一步研究。此外，自噬-溶酶体途径也可促进Aβ清除，miRNA可直接或间接调节自噬-溶酶体系统。Beclin-1是自噬过程的催化剂，增加miR-30a可抑制Beclin-1蛋白表达，破坏自噬-溶酶体途径〔53〕。miR-106b、miR-124下调会通过抑制SIRT1下调Beclin-1，抑制自噬-溶酶体途径对Aβ的清除〔54，55〕。TREM2作为AD的风险基因，可识别胞外的Aβ42，促进自噬清除Aβ42〔56〕。miR-34a可负向调控TREM2，抑制Aβ清除。AD中miRNA对Aβ42清除的调控涉及蛋白酶体降解清除、血脑屏障转运清除和自噬清除等途径。然而，目前的研究还存在很多难点，无论是miRNA对Aβ的生成还是清除的调节都有很多分子层面的机制没有明晰。

综上，miRNA的异常表达是AD的特征之一，前者在转录后水平调节相关基因表达参与了AD的发生发展。当前研究已知miRNA可以调控神经发生、细胞凋亡、细胞周期再入、神经炎症、Tau蛋白病变及Aβ沉积。miRNA可通过Sox9、Numb1、MBD1等调节增殖分化间的平衡进而调控神经发生；可通过抑制抗凋亡因子、促进促凋亡因子促进AD中的细胞凋亡；可通过促进GSK-3β、CDK5、MAPK表达上调导致Tau过磷酸化；可通过上调APP、BACE1等促进Aβ沉积，促进LRP1、2和Beclin-1表达加速Aβ清除；还可通过下调促炎因子和上调抗炎因子来抑制炎症反应起神经保护作用。另外，miRNA可与各种信号通路相互作用，形成复杂的调解网络共同影响AD的发生、发展。目前为止miRNA对AD的作用机制尚不十分明确，但其为治疗AD提供了靶点。