新生儿坏死性小肠结肠炎发病机制的研究进展*

王 静 综述,米弘瑛 审校

(1.大理大学，云南大理671003；2.云南省第一人民医院儿科，昆明 650032;3.昆明理工大学附属医学院，昆明 650032)

坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿期最常见且病死率较高的外科急危重症，多发于早产儿，以呕吐、腹胀、血便为典型的临床表现。美国和加拿大的多中心新生儿网络数据库显示，出生体重500～1 500 g的早产儿中，NEC的发生率为7%，病死率为20%～30%，近几年无明显改善[1-3]。有研究揭示NEC的发生与新生儿肠道动力和肠道黏膜屏障不成熟、免疫系统的易感性、肠道微生物不成熟与失衡、喂养不当等有关[4-8]，目前国内外研究尚未能阐明NEC的发病机制。

1 既往研究

新生儿NEC是由多种因素导致的肠道炎症性疾病，发病机制复杂，常常与脓毒血症、全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、循环衰竭等全身炎症性疾病密切相关，其中早产和感染是其独立相关的危险因素，尤其由革兰阴性菌引起的脓毒症伴发NEC时，病情较危重，肠穿孔发生率及病死率较高[9-11]。既往临床研究显示：NEC小鼠回肠组织Toll样受体(Toll like receptor，TLR)4及核因子-κB(NF-κB)表达升高,以及TLR9表达下降,提示TLR4介导的NF-κB信号活化是导致NEC发病的重要机制之一[12-13]。由肠细胞和巨噬细胞产生的炎性介质，尤其是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1、血小板活化因子和一氧化氮(NO)在NEC炎性反应中发挥重要的作用[14]。已证实血小板活化因子能够诱导TLR4的表达和信号传导，并募集大量炎性细胞及补体参与肠黏膜上皮的炎性级联反应[15]。

肠道炎性反应常引起肠道黏膜上皮弥漫性水肿、缺血、坏死、脱落等病理改变，严重者导致肠穿孔，引起急性腹膜炎、弥散性血管内凝血、脓毒症性休克、多器官功能障碍等并发症。临床上多以禁食、胃肠减压、营养支持、抗感染、维持水电解质及酸碱平衡、纠正凝血功能障碍等治疗为主[16]，对危重患儿采取外科手术治疗[17-18]，目前尚无特异性治疗方案。消皮素D(gasdermin D，GSDMD)的发现，无疑为探索新生儿NEC的发病机制及治疗方法提供了新的研究方向。

2 研究新进展

2.1 由GSDMD介导的细胞焦亡可能参与NEC的炎症机制

新生儿NEC是多种因素相互作用的结果，因其发病机制尚未完全清楚，目前临床上尚无突破性的有效治疗方案，导致其病死率较高、预后较差。随着GSDMD家族的发现及研究的深入，GSDMD分子机制和在炎症中的作用逐渐被广泛认识。细胞焦亡是由GSDMD介导的一种特殊的程序性细胞死亡机制，无论在坏死机制上还是在细胞死亡形态上的分析，均与细胞凋亡和其他类型的细胞坏死不同。

近年来研究发现，GSDMD作为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)-1、caspase-4、caspase-5及caspase-11的下游分子，被切割成有活性的N-端结构域和无活性的C-端结构域，有活性的N-端结构与细胞膜上特定的磷脂分子如磷脂酰肌醇磷酸酯、磷脂酰丝氨酸和心磷脂等结合，介导非离子选择性孔道的形成，耗散细胞内外的离子渗透梯度[19-22]；而被磷酸化激活的混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)同时与质膜结合形成可渗透的离子通道，二者共同发挥成孔作用改变细胞内外渗透压的平衡[23]，导致细胞膨胀和崩解死亡,最后释放出IL-1β等炎性介质发挥致炎作用[24]，同时将细胞内的微生物暴露出来，有利于机体对病原微生物的清除，在介导细胞裂解的过程中MLKL分子也发挥了重要作用。

在细胞焦亡的过程中，GSDMD是如何精确调控细胞死亡、如何参与NEC的发病及探索GSDMD特异性抑制分子是未来研究的重点方向。CHEN等[23]研究发现，GSDMD-N端存在α-螺旋结构，而MLKL中的N-末端也存在这种结构，这是MLKL齐聚和功能所必需的，因此，这种α结构可能是GSDMD-N端寡聚和细胞死亡所必需的，推测破坏这种结构就可能会抑制细胞焦亡的发生。相关研究显示，caspase-1、IL-1β、IL-18、NLRP3等与细胞焦亡相关的分子在肠上皮及小鼠NEC模型中显著高表达，从而提出细胞焦亡可能参与新生儿NEC的发病机制，且GSDMD基因有望成为治疗NEC的靶基因位点[25]。

GSDMD不仅是介导细胞焦亡的关键分子，还参与中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)的发生。最新研究发现，这两种细胞死亡方式均在NEC的肠黏膜上皮炎性反应中发挥不可或缺的作用。

2.2 NETs在NEC发生、发展中的作用

NETs是依赖于GSDMD形成的一种中性粒细胞死亡的特殊形式，它将细胞核DNA去致密化，随后排出染色质，染色质被细胞毒性颗粒蛋白包裹，如髓过氧化物酶(MPO)、弹性蛋白酶和其他蛋白酶等，这些被特殊修饰的染色质和其他蛋白质结构被称为NETs，这个过程也被称作NETosis[26-27]。最新研究发现，GSDMD在NETs的形成中发挥重要作用，在中性粒细胞中，GSDMD被包括中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)在内的丝氨酸蛋白酶裂解，由被切割后的GSDMD-N端结构域的成孔作用导致细胞死亡[28]，在NETosis的过程中，GSDMD-N端结构域在细胞膜上形成孔以允许NETs的释放[29-30]。除此之外，NETosis的发生与乙酸肉豆蔻酸佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)也密不可分[31]，PMA通过Nox依赖途径诱导NETosis的发生，还能引起补体蛋白的最大释放。无论是这种中性粒细胞的特殊死亡，还是大量炎性物质及补体成分的释放，均可介导机体的炎症级联反应呈瀑布式的爆发。目前这种NETs的特殊死亡形式已经被证实参与了NEC的发病[30]，但其在NEC中具体的信号通路仍然不清楚，还有待进一步研究。

既往研究表明，中性粒细胞表面抗原CD64被证实对鉴别早发型和晚发型败血症及NEC具有良好的诊断价值[32]。通过比较CD64和C反应蛋白的诊断价值，发现CD64在LOS/NEC中是一个比C反应蛋白好得多的早期预警生物标记物[33-34]。总之，中性粒细胞CD64表达作为一种监测生物标记物，对识别极低出生体重儿LOS/NEC既灵敏(89%)又特异(98%)[35]。只是CD64在NEC诊断过程中具体的参考值范围尚不清楚,其在NEC中的具体作用也未被完全详细阐明。由此推测，在NEC的发病过程中，可能存在早期预警的生物标记物。

2.3 GSDMD介导细胞焦亡与NETSs的发生的机制

作为同时介导细胞焦亡及NETs这两种程序性细胞死亡的关键分子，GSDMD是如何介导细胞焦亡与NETs的发生？这两种机制是否只是在同一细胞死亡过程中的不同阶段，即细胞膜完整性被GSDMD-N端结构的成孔作用破坏导致细胞焦亡，在细胞膜被破坏后释放细胞内染色质及其他蛋白成分形成NETs，二者共同发挥作用；还是GSDMD通过不同的受体与配体结合作用于不同的细胞，独立介导细胞焦亡和NETs的发生。有学者提出，在感染早期NETs的形成涉及中性粒细胞[36]，但中性粒细胞不发生溶解并保持多种任务能力，与上述设想有冲突，还有待于进一步深入研究。但针对GSDMD基因的特异性抑制因子阻止其表达可以阻断细胞焦亡和NETs的发展过程是毫无疑问的。新生儿NEC的发病多伴随着脓毒症，感染、细胞焦亡、NETs等多种机制可能相互作用，形成恶性循环，而GSDMD是多种机制中的关键，阻断其基因表达有可能打破这种恶性循环，为治疗新生儿NEC提供新的理论依据。

3 展 望

由GSDMD介导的细胞焦亡和NETs在NEC发生、发展中的作用越来越受关注，近年来已有学者在研究能够阻断GSDMD基因表达的特异性抑制分子，并试图阐述其信号分子通路，揭示其在NEC中的具体参与机制，但目前还无实质性的突破。虽然在研究过程中也发现了有早期监测意义的生物化学指标，但还需临床上的进一步筛选。如能发现可以用来监测NEC的特异性生物化学指标，并且研究出GSDMD的有效特异性抑制分子，就可以做到早期诊断、早期治疗，从而提高NEC的临床治愈率并改善预后。