巨噬细胞回输治疗炎症相关疾病的研究进展①

卢羿同 王 亮 马鹏飞 白 健 秦鸿雁

（空军军医大学基础医学院医学遗传与发育生物学教研室，西安710032）

近年来，基于免疫调节功能的细胞疗法已被美国食品药品监督管理局批准上市，包括应用于癌症治疗的免疫激活嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）细胞治疗，以及应用于炎症性肠炎和严重肢体缺血治疗的间充质干细胞（mesenchy‐mal stromal cells，MSCs）治疗［1-4］。巨噬细胞是人体重要的天然免疫细胞，从巨噬细胞被发现后的100多年里，人们对其的研究就一直热情不减［5-6］。巨噬细胞对疾病的治疗最早可以追溯到FIDLER博士的研究工作，早在1974年，他利用预激活的小鼠腹腔巨噬细胞进行回输，观察到其对B16细胞肺转移具有显著抑制作用［7］。之后，国内外学者包括本课题组纷纷开启了自体巨噬细胞回输治疗组织损伤、退行性病变、器官纤维化及肿瘤等多种疾病的基础和临床研究［8-11］。然而，由于巨噬细胞具有活化、起源和功能的异质性，探讨不同巨噬细胞亚群在疾病中的作用是将其有效用于疾病治疗的前提［12］。因而课题组结合巨噬细胞异质性的研究，综述了目前国内外利用不同类型巨噬细胞治疗炎症相关疾病的研究进展。

1 巨噬细胞发育和起源异质性

对于巨噬细胞（macrophages，Mφ）起源的探索，最早可追溯到1968年VAN FURTH等［13］提出的单核巨噬系统（mononuclear phagocyte system，MPS），该系统最初包括组织定居Mφ、循环的单核细胞和Mφ，后来也包括树突状细胞（dendritic cell，DC）。然而，随着细胞命运图谱研究的深入及谱系示踪技术的出现，研究者们对组织定居Mφ的起源有了新的发现，其中最重要的两个发现是大部分的组织定居Mφ起源于胚胎时期，且在整个生命周期中具有自我更新能力［14］。研究显示，Mφ的发育分为3个连续的造血波，第1波即原始造血从E7.0天开始，在胚胎卵黄囊血岛中产生红细胞、巨核细胞和Mφ祖细胞。随后Mφ祖细胞会在脑内产生Mφ前体，进而分化为小胶质细胞。第2波即暂时定向造血，发生在卵黄囊的造血内皮细胞中，在E8.25天时形成血管系统，并产生红细胞髓样祖细胞（erythro-myeloid progenitors，EMPs），这些祖细胞将产生第一个胚胎单核细胞。随后，胚胎单核细胞会渗透到除大脑外的每一个组织，并分化成大多数组织的定居Mφ［15-17］。第3波开始于E10.5天，在主动脉-性腺-中肾区胚胎固有造血内皮处产生造血干细胞（hemato‐poietic stem cells，HSC）。E10.5天后，HSC也会出现于脐动脉和卵黄动脉以及胎盘和卵黄囊。EMPs、淋巴髓系祖细胞和HSC随即进入胎肝，使其成为主要的造血器官，直到妊娠晚期［18］。在围产期，HSC也能产生胚胎单核细胞，生成少量的定居Mφ。成体造血是从骨髓中开始，仅少量的组织定居Mφ在出生后由骨髓单核细胞分化而来，如肠道组织定居Mφ等。

目前公认的是，大多数组织定居巨噬细胞是来自暂时定向造血波时卵黄囊中出现的EMPs。在Mφ发育过程中，至少有两条调控EMPs分化的信号通路。第一种是不依赖c-Myb表达的卵黄囊Mφ，也称为原始巨噬细胞，它绕过了经典的单核细胞中间体，最终在脑内产生小胶质细胞并迅速被血脑屏障隔离［19］。第二种依赖c-Myb表达，一旦EMPs在胎肝中出现，就开始产生胚胎单核细胞。EMPs来源的胚胎单核细胞迅速进入其他组织，分化成成体组织定居Mφ［20］。

2 Mφ活化和功能异质性

正常生理功能下，Mφ具有吞噬和抗原提呈能力。然而，在局部组织炎性微环境的刺激下会呈现出不同的极化状态，并具有相应的基因表达谱［21］。目前根据其表面受体和功能特征，Mφ被分为两种极化类型，即经典活化的M1型Mφ和替代活化的M2型Mφ。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）被用来诱导M1型Mφ极化。M1型Mφ通过释放大量促炎因子，如白介素12（interleukin-12，IL-12）、IFN-γ、肿瘤坏死因子α（tu‐mor necrosis factor-α，TNF-α）等，促进Ⅰ型辅助T（type 1 T helper，Th1）细胞免疫应答，发挥组织破坏和抗肿瘤功能。M1型Mφ的极化由JAK-STAT、NF-κB和TLR4信号和转录因子IRF5/IRF8介导。相对于M1型Mφ，M2型Mφ则由IL-4诱导，通过上调甘露糖受体的表达，释放免疫调节因子IL-10、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等，参与Th2细胞免疫应答，促进肿瘤生长和扩散［22］。而肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）在许多恶性肿瘤中表现为M2样Mφ表型，与肿瘤患者的不良预后相关。研究表明，STAT6和IRF4均可介导M2型Mφ的极化［23］。

3 回输不同类型Mφ对炎症相关疾病的治疗

3.1 肝脏相关疾病治疗在肝纤维化领域，Mφ根据疾病分期和Mφ极化类型发挥促纤维化或抗纤维化作用。THOMAS等［24］的研究表明回输骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）对四氯化碳诱发的慢性肝纤维化具有治疗作用。然而，由于Mφ在起源、极化和功能上具有复杂的异质性，我们有理由认为，Mφ的不同亚群对同种疾病可能发挥不同作用。因此，课题组进一步探讨了不同极化类型的Mφ在小鼠肝纤维化细胞治疗中的精准作用，发现与M0或M2型Mφ相比，回输M1型BMDMs对肝纤维化治疗效果最好。进一步的机制研究表明：回输M1型Mφ减少了肝星形细胞的数量和活性，促进内源性Mφ向纤维化肝脏的募集，并产生基质金属蛋白酶和肝生长因子促进胶原降解和肝细胞增殖。同时，M1型Mφ也增加了纤维化肝脏中自然杀伤细胞的数量，释放了肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体，诱导肝星形细胞凋亡［10］。最近，MORONI等［25］对9例肝硬化晚期患者进行了自体Mφ回输治疗的首次临床试验，结果表明，所有受试者在一年内均存活且未进行肝移植，达到了安全性和可行性的初步结果。这项研究为肝硬化和其他纤维化疾病的Mφ治疗提供了依据，也为进一步使用M1型Mφ治疗提供了基础。此外，其他研究也表明可利用更明确的亚群来挖掘Mφ的治疗潜力。例如，MELIN等［26］报道移植肝脏定居MφKupffer细胞对对乙酰氨基酚诱发的急性肝损伤或肝脏缺血再灌注损伤具有治疗作用。提示，终末分化的或不同来源的巨噬细胞均可能成为治疗肝脏相关疾病的候选细胞。

3.2 肺脏相关疾病治疗肺泡蛋白沉积症是由肺泡Mφ表面GM-CSF受体信号缺陷引起的肺表面活性脂蛋白清除不良，进而导致患者低氧性呼吸衰竭［27］。肺泡Mφ由于可吞噬肺表面活性物质，降低肺泡张力、维持肺泡容量的稳定，在肺泡蛋白沉积症中发挥重要调控作用，因而重塑Mφ功能成为治疗肺泡蛋白沉积症的新策略。SUZUKI等［28］利用GM-CSF受体（csf2rb基因）敲除小鼠建立肺泡蛋白沉积症模型，发现将BMDMs移植到csf2rb-/-小鼠的肺中，不仅可有效治疗小鼠的肺泡蛋白沉积症，而且移植的BMDMs能在肺脏内增殖，在移植后1年仍可在肺脏中发现，并且没有引起免疫排斥反应。进而，该团队将慢病毒介导的csf2rb基因表达纠正后的csf2rb+/+BMDMs移植到csf2rb-/-小鼠体内，发现也可消除小鼠肺泡蛋白沉积。而且，移植后野生型和csf2rb基因纠正型的Mφ都失去了BMDMs的特征，获得了肺泡Mφ的特征［29］。令人感兴趣的是，LACHMANN等［30］的研究表明，给罹患肺泡蛋白沉积症小鼠回输骨髓前体细胞同样能定植在肺泡，并且可获得肺泡Mφ表型，发挥疗效。这一发现与SU‐ZUKI等［28］的观察结果相一致，即肺脏微环境在决定Mφ的表型和功能方面起至关重要的作用。且自体BMDMs回输对遗传性肺泡蛋白沉积症患者具有潜在的治疗作用。

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征是呼吸衰竭的主要原因，但目前尚无有效的药物治疗［31］。肺泡巨噬细胞在ALI的急性期、初始期、慢性期和缓解期均发挥重要作用，是潜在的治疗靶点。LIU等［8］构建了分泌IL-4的Mφ，并通过肺脏Mφ移植治疗ALI。结果表明，肺脏巨噬细胞移植后通过减轻ALI小鼠的肺部炎症、减轻组织损伤、减少肺泡Mφ死亡、降低死亡率等改善了ALI。上述结果提示：不同极化类型的肺脏Mφ移植可治疗ALI。

3.3 肾脏相关疾病治疗肾脏的再生能力有限，而在慢性肾病中诱导肾修复的疗法很少［32］。因此，细胞疗法等干预措施正在广泛发展，成为预防终末期肾衰竭的替代治疗方式［33］。在许多慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）小鼠模型中，M2型Mφ具有抗炎和修复活性，被用于细胞治疗。但研究结果却并不一致［34-35］。DAVID教授的研究小组研究了在急性肾衰竭和CKD动物模型中输入M2型Mφ的作用。该团队利用阿霉素肾病小鼠模型证明，与IL-4/IL-13诱导的M2a型Mφ相比，静脉回输IL-10/TGF-β诱导的M2c型脾脏来源CD11b+细胞，可增强对肾脏结构和功能损伤的保护作用。在严重联合免疫缺陷的阿霉素肾病小鼠模型中，回输脾脏来源的M2a型Mφ与肾损伤的恶化有关。这些M2c型Mφ高表达B7-H4，而M2a型Mφ则不表达。因此，作者认为M2c型Mφ能发挥肾脏保护作用是由于表达了共同刺激分子B7-H4，进而抑制T细胞增殖并诱导调节性T细胞产生。同时，也证明输入M2c型Mφ在疾病过程中并没有改变自身的表型。相比之下，CAO等［34］和WANG等［35］研究表明，使用相同的小鼠模型，可能由于Mφ表型的改变，从骨髓中获得的M2型BMDMs未能减少蛋白尿和维持肾功能。进一步研究表明，输注M2型BMDMs可能在体内失去了抑制功能，而脾脏来源的M2型Mφ保持了其抑制功能。上述研究提示，在应用Mφ进行疾病治疗时，其来源是一个需要考虑的关键问题。

此外，RAQUEL等［36］也研究了回输单核/巨噬细胞对糖尿病肾病大鼠的治疗作用。通过利用链脲佐菌素诱发糖尿病模型，4周后经颈静脉回输BMDMs后，作者发现，内源性给予糖尿病大鼠BMD‐Ms通过减少肾内TGF-β和聚集在肾小球内的精氨酸酶阳性Mφ，改善了Ⅰ型糖尿病大鼠模型的肾小球功能和形态。上述研究均表明：针对不同的肾脏疾病，选择不同来源或极化的Mφ进行回输具有不同的效果。

3.4 肿瘤相关治疗早在1974年，FIDLER等［7］报道将黑色素瘤（B16）培养基激活的Mφ输注到荷瘤小鼠体内可以减少肿瘤的肺转移。1990年AN‐DREESEN等［37］首次报道了IFN-γ 激活的自体TAMs的体外获得及再输注的首次临床试验。其研究表明：体外共培养的Mφ能够识别和杀伤肿瘤细胞，但利用转移瘤模型却不能产生杀伤肿瘤细胞效应。之后，随着大规模血液单核细胞体外培养技术的成熟，来自癌症患者的临床试验证明了注射IFN-γ或LPS激活的自体单核细胞分化的Mφ在治疗上的可行性和安全性。人类Mφ过继免疫治疗的给药方式可通过多种途径实现：如经静脉、腹腔、胸膜内或选择性肝动脉灌注。通过回输铟111标记Mφ进行体内分布研究时显示，腹腔注射的Mφ可定位于腹腔肿瘤包块处，而在经体循环回输后则定位于肝脏、脾脏［38］。值得注意的是，在这些研究中，所有类型的Mφ靶向免疫治疗仅在抑制肿瘤转移方面有效，而很少观察到肿瘤原发灶的消退，原因可能为回输后的Mφ不能到达肿瘤原发灶内或被肿瘤微环境重新诱导为TAMs，不能发挥抗肿瘤作用。

由于回输Mφ并未起到治疗肿瘤的作用，研究者们提出了更多靶向TAMs的治疗策略，包括：抑制Mφ在肿瘤中的募集和存活；TAMs功能再教育，即将M2样TAMs再教育为M1样的TAMs，发挥抗肿瘤作用；Mφ介导的抗体依赖的细胞毒杀伤效应；以及应用基因工程修饰Mφ，如CAR-Mφ靶向杀伤肿瘤等［39］。

4 展望

总之，上述研究均显示：Mφ不仅在先天免疫中发挥重要作用，在急慢性炎症和肿瘤的发生发展中也发挥至关重要的调控作用。利用Mφ回输治疗在肝纤维化、肺泡沉积症、糖尿病肾病、肿瘤中的相关研究中均取得了一定的进展。然而，由于Mφ具有起源、活化和功能的异质性，因而，深入研究Mφ异质性在不同疾病中的作用和机制，是将来实现临床靶向Mφ治疗疾病的前提。而且我们有理由相信，在分子机制揭示的前提下，利用基因编辑技术体外改造Mφ可能是未来靶向Mφ治疗疾病的重要途径之一。把Mφ这一古老的细胞用多种手段改造武装后，有望成为治疗人类多种疾病的候选明星细胞。其也将成为继干细胞疗法、DC疗法和CAR-T疗法后的另一种强大的细胞治疗技术，为治愈疾病提供新策略。