不明原因复发性流产中Th17/ Treg免疫平衡机制研究进展①

方紫璇 余 楠 （华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，武汉430030）

胚胎相对于母体而言是半同种异体移植体，在正常妊娠过程中母体对胎儿不产生排斥反应，其中母胎免疫耐受起至关重要的作用。母胎免疫失衡易导致妊娠紊乱，诱发子痫前期、复发性流产（recur⁃rent spontaneous abortion，RSA）等病理妊娠现象。RSA 是指与同一性伴侣连续发生3 次或3 次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失［1-2］。RSA病因较多，包括亲代和胚胎染色体、解剖结构、内分泌、感染、遗传因素和血栓前状态等［3］。但约50%患者发病成因尚不明确，称为不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［4］。

CD4+T 细胞是人体免疫系统中一类重要的免疫细胞，在母胎免疫耐受机制中发挥重要作用。CD4+T 细胞可调节先天性和适应性免疫系统，在不同细胞因子介导下分化形成Th1、Th2、Th17、Treg 等不同亚群［5］。以往研究者以Th1/Th2 偏倚解释诸多免疫所致的组织损伤和慢性炎症等疾病，但近年来研究发现Th17/Treg 偏倚对解释母胎免疫耐受现象更为重要［5-6］。本文就Th17/Treg 平衡异常导致的URSA 可能的发病机制及其相应治疗方法的最新研究进展进行综述，以期为临床揭示URSA 发生、发展及治疗提供参考。

1 Th17：促炎细胞

1.2 Th17 的调节 不同细胞因子介导CD4+T 细胞分化为不同的细胞亚群。在初始CD4+T细胞的分化过程中，TGF-β 作用可促进 Treg 的分化和增殖，而TGF-β 和 IL-6 共同作用促使 CD4+T 细胞分化形成Th17［9］。也有研究认为，在小鼠中 TGF-β 和 IL-6 的共同诱导下形成Th17，而人体中则由IL-1β 和IL-6或IL-23共同促进Th17分化形成［10］。TGF-β 在Th17分化和增殖中发挥重要作用：一方面TGF-β 通过对Th1 和 Th2 分泌 的 IFN-γ 和 IL-4 的 抑制 作 用实 现Th17 的增殖，另一方面TGF-β 直接刺激原始CD4+T细胞分化，同时TGF-β 和IL-6 能诱导激活维甲酸孤核受体γt（retinoid-related orphan receptor γt，RORγt）和RORα，该受体是介导Th17 分化方向的重要转录因子［5，9］，其活性可受配体依赖性的方式调节，例如乙酰化和泛素化及与各种辅因子的相互作用，能改变其活性进而实现对Th17分化的调节［8］。IL-6可有效抑制Treg 分化，促进CD4+T 细胞向Th17 分化方向进行。但 Th1 和 Th2 的效应因子 IFN-γ 和 IL-4 能抑制 Th17 的分化，IFN-γ 通过调节 STAT1 通路活性来抑制 Th17 的分化［5，9］。IL-27 对 Th17 的调节作用与IFN-γ 类似，并通过 STAT1 通路抑制 Th17 转录因子RORγt 来减少IL-17A 的产生，而对诱导产生的适应性Treg（iTreg）的抑制作用是并非通过STAT1 通路进行［9，11-12］。相较于 STAT1 表达水平降低，Th17 中STAT3 途径表达水平持稳。STAT3 通路在Th17 的分化中有重要作用，能调节RORγt和RORα 及IL-17的表达水平，同时在极化条件下，Th17 诱导RORγt需依赖STAT3 通路，并在IL-6、IL-23 等细胞因子的刺激下协同作用促进Th17的分化［8-9］。

除细胞因子对Th17 分化和增殖直接调控外，Treg 可通过特定因子作用间接调控Th17 的增殖，体外Treg 能分泌TGF-β 因子进行调控，小鼠体内Treg通过上调IL-2 受体α 链（CD25）含量或激活STAT5通路来调节IL-2 mRNA 表达，IL-2 信号因子促进Th17的分化和增殖［13］。

1.3 妊娠期Th17及相关因子变化 与健康状态相比，在 URSA 中，Th17 及 Th17 相关细胞因子含量呈现不同变化趋势。健康未孕妇女（有至少1 次成功孕产史）的血清中IL-17水平明显较低，而Th17相关细胞因子 IL-21、IL-22、IL-17A 在 URSA 患者血清中呈现增高趋势，在URSA 患者的外周血中ROR-γt mRNA 表达增多［14］。在 Th17 的调节机制中，PD-1/PD-L1 能改变Th17 细胞的含量，胃癌患者中主要通过减少 ROR-γt的 mRNA 表达，使得 Th17 分化减少。而在体外，PD1抑制剂（Ad-sh-PD1）可通过增加miR-21表达，增加Th17的数量［15］。

人体中Th17 相关细胞因子含量的变化提示病理妊娠的发生。在正常的妊娠过程中，胚胎相当于同种异体移植，其中胎儿自身抗原会刺激母体产生多种免疫炎症反应，导致相关因子增多，例如IL-6、IL-12、IL-18和TNF-α 等。在相应细胞因子中，IL-22的增加在正常妊娠时与Th2相关的细胞因子IL-4有关，两者在血清中呈现正相关的表达趋势，而在URSA中IL-22 的含量变化与Th17 相关细胞因子（IL-17A、IL-17F）呈正相关。IL-22 在建立母胎联系时，参与半同种异体移植的免疫调节过程，对于胚胎正常种植，实现妊娠具有重要意义［16］。在URSA 患者中，表现出外周血及蜕膜中Th17相关因子及IL-23含量的升高，以及与Th17 相关的维甲酸孤核受体RORC 的升高，提示URSA 的影响因素可能与Th17 的增多及细胞因子变化相关［17］。

2 Treg：免疫耐受

2.1 Treg 的来源及分泌 Treg 是 CD4+T 细胞的一个亚群，能表达IL-2 受体，通过细胞之间接触和分泌的 IL-10、TGF-β 发挥免疫调控作用。Treg 种类较多，包括天然产生的自然 Treg（nTreg）、iTreg 等。其中nTreg 在胸腺中产生，受转录因子Foxp3 调节，iTreg 则由原始T 细胞在外周血或体外受到抗原和TGF-β 的诱导后分化形成［9］。Treg 在抑制自身免疫和同种异体移植的耐受中有重要作用，主要机制包括：Treg 组成性高表达细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），能竞争性地结合效应T 细胞活化所需的共刺激信号B7 分子，抑制T 细胞活化，同时可竞争性地抑制T 淋巴细胞表面共刺激分子CD28，从而阻碍第二信号的传递，使效应T 细胞进入失能状态［18］。其次，Treg可分泌产生IL-10、TGF-β、IL-35等细胞因子发挥免疫调节功能，可诱导T 细胞向Th2转化，下调自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）的杀伤功能［18-19］。Treg 具有抑制抗原特异性免疫的作用，对于免疫平衡的维持十分重要，Treg的过度激活易导致免疫耐受的失衡，从而诱发多种自身免疫性疾病的产生。

2.2 Treg 的调节 Treg 的分化与增殖受到相应细胞因子的调节。Foxp3 是人体中CD4+CD25+T 细胞表达的转录调节因子，是维持Treg 稳定和生长的重要基因［20］。在URSA 中，Foxp3伴随Treg在外周血和蜕膜中呈现低表达趋势，而Foxp3启动子在URSA中甲基化，进而导致Foxp3 蛋白低表达，Treg 功能退化，最终导致 URSA 的发生［21］。IL-4 或 IL-13 通过共受体IL-4Rα 激活JAK1/JAK3，进而磷酸二聚化STAT6，介导 Foxp3 表达，进而影响 Treg 的功能。信号转导和转录激活因子6（STAT6）的单核苷酸多态性（SNPs）与免疫反应有关，其中SNPs 为STAT6 rs324011 与 Treg 相关基因的低表达有关［22］。STAT3是胞质内信号转导和转录激活因子家族（STAT）中的另一员，也影响Treg 表达。在急性冠心症（CAS）患者中，磷酸化STAT3+T（pSTAT3+T）细胞比例增加，通过影响JAK2/STAT3 通路，即减少JAK2 磷酸化和STAT3 表达，来降低 Treg 数量和功能表达［23］。IL-27作用机制尚不明确，相关研究发现，腺相关病毒AAV-IL-27 能够有效抑制肿瘤生长，其机制主要为通过 IL-27R-STAT1 信号通路来抑制 Treg、IL-2R 和IL-2 表达，同时，AAV-IL-27 可抵消 anti-PD-1 的抗性［24］。然而有研究者却认为特异性IL-27 受体并不影响Treg 的生长和存活，甚至IL-27 能增强Treg 的稳定性［25］。

2.3 妊娠期Treg 及相关因子变化 在正常妊娠过程中，Treg数量和比例呈现增高趋势。有研究发现，同种异体妊娠的子宫引流盆腔淋巴结中Treg 组成比例有明显的升高。母体IL-6 能减少Treg 在子宫中的累积，但在同基因妊娠的子宫颈中，Treg呈现增加趋势，同时胎儿抗原的含量与子宫胎盘界面Treg的积累量相关联［26］。Treg缺失的淋巴细胞会导致流产发生，而同种异体妊娠小鼠体内的CD4+CD25+Treg能有效防止妊娠前4.5 d的胎儿排斥反应，说明Treg对于维持特异性的同种异性抗原耐受和小鼠的孕早期胚胎移植有重要作用［27］。QIAN 等［3］研究显示，健康妊娠妇女与健康未妊娠妇女相比，Treg 在CD4+T 细胞中的占比明显增高，但URSA 妊娠和未妊娠患者则差异不大。与健康妊娠妇女相比，UR⁃SA 妊娠患者蜕膜组织中 IL-6、TNF-α mRNA 的表达明显增高，而 Foxp3、CTLA-4 和 TGF-β1 mRNA 的表达则明显降低。说明Treg 及Treg 相关因子含量改变可能是导致URSA 患者母胎免疫失衡的重要因素。也有研究显示，Treg 在URSA 患者外周血和蜕膜中含量均减少［17］，Foxp3 mRNA 的表达在外周血中呈下降趋势，外周血中Foxp3 水平下降，血清中IL-10 水平降低［14，21］。Treg 及其相关细胞因子在妊娠过程中可调控免疫反应，因此含量水平的偏倚提示病理妊娠的形成。

3 Th17/ Treg平衡

3.1 Th17/Treg 及其他细胞因子失衡和不明原因复发性流产

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3.1.1 细胞数量异常与不明原因复发性流产Th17 与Treg 虽起源于同种细胞，但在免疫系统中的作用却是相互拮抗的。Th17 的促炎性与Treg 对免疫的调节性相互作用构成平衡，在免疫耐受与免疫防御中具有重要作用。健康的免疫系统可调节对自身抗原和外源生物的免疫功能，正常妊娠中胚胎的抗原会对母体的免疫系统产生影响，其中Treg 能调节Th17含量变化并保护胚胎免受母体的攻击［19］。在母胎免疫耐受系统中Th17和Treg具有重要影响，其含量变化可能会导致病理妊娠的发生，例如子痫前期、URSA 等［10，19］。

一般而言，正常妊娠人体中特殊Treg 类细胞，如CD4+CD25+Treg，在孕早期呈现增高趋势，之后在孕中期达到顶峰后开始下降，产后下降至较低水平，但与孕前相比，Treg 水平仍然较高［28-29］。孕晚期胎儿Treg水平降低有利于分娩的开始。相反，CD4dimCD25highFoxp3+Treg 在妊娠人体孕中期开始下降。同时，Foxp3+Treg 的持续表达能抑制母体免疫反应对胎儿的伤害［29］。URSA 患者和正常妊娠的蜕膜免疫细胞中CD4+T 细胞比例变化不大，但在URSA 患者中Foxp3+、Treg细胞数量降低，IL-17+、Th17细胞数量升高，且 Th17/Treg呈增高趋势［3，30］，提示URSA 的发生可能与Th17/Treg平衡偏倚相关联。

3.1.2 细胞因子异常与URSA 在URSA 患者中，血清中 IL-17、IL-21 和 IL-22 含量升高，而 IL-10、TGF-β 含量降低［16］，外周血中 Foxp3+、TGF-β 基因表达水平降低，IL-6、IL-17、IL-23 基因表达水平升高［30］，提示基因表达及相关细胞因子含量变化与URSA蜕膜和外周血中Th17、Treg变化相关联。

3.2 细胞参与调节Th17/Treg平衡

3.2.1 滋养层细胞 滋养层细胞与母体免疫细胞有双向调节机制，在正常妊娠周期中，人绒毛膜滋养层细胞（HTR8/Svneo）能促进 CD4+Foxp3+Treg 的增长及相关细胞因子TGF-β1 的表达，促进Th17 的增殖和凋亡基因表达。而Th17/Treg 细胞环境控制性地调节滋养层细胞的生长增殖［31］。有研究显示，Toll 样受体4（TLR4）通过直接或间接诱导滋养细胞异常凋亡，诱发母-胎免疫失衡导致URSA［32］。此外，TLR4诱导获得性免疫影响Treg分化、活化、增殖和功能，从而导致Th17/Treg 平衡失调，引起URSA，但其中的影响机制尚不明确［33］。在先兆子痫患者中，滋养层细胞蛋白CD81 在体内表达上调，显示母体基膜层和外周血中的Treg 含量降低，Th17 含量增加［34］。提示在其他病理妊娠情况下，滋养层细胞对母体Th17/Treg 平衡的调节是导致疾病的重要因素之一。

3.2.2 树突状细胞（dendritic cells，DCs） DCs 在调节免疫耐受中发挥重要作用，促进妊娠期正常的免疫应答反应，有助于妊娠。妊娠周期中分泌妊娠特异性糖蛋白1a（PSG1a），能介导 DCs 的分化，分化后的 DCs 可促进 TGF-β 或 IL-10 的分泌以及程序性死亡配体（PD-L1）的应答反应，增加小鼠中Treg 的数量［34］。半乳糖 Gal-1 调节 DCs 诱导产生的 Treg/Th17 时，抑制 Th17 分化，促进 Treg 的产生，在介导Treg的产生机制中主要是通过影响IL-27的含量，抑制Th17，促进Treg增殖［35］。

3.3 细胞因子参与调节Th17/Treg平衡

3.3.1 IL-6 Treg 和Th17 相关因子通过共同调节两种细胞数量变化对母胎免疫耐受产生影响。IL-6是一类调节Th17/Treg平衡的重要细胞因子，在UR⁃SA患者血清中，IL-6的水平明显增高［14］，促进CD4+T细胞向Th17 方向进行分化。有研究认为IL-6 含量水平与 Th17、ROR-γt 呈正相关，而与 Treg、Foxp3 呈负相关［14］，IL-6 可能通过阻断 Foxp3 基因的表达抑制Treg产生，刺激ROR-γt的表达促进Th17增殖。

3.3.2 IL-27 IL-27是IL-12/IL-6家族的一类异丁烯细胞因子，在许多细胞，尤其是T细胞中对先天性免疫和适应性免疫都发挥重要调节作用。在URSA患者的蜕膜中，IL-27 表达减少，同时IL-27 可抑制IL-17，促进IL-10表达［36］，因此URSA中IL-17的水平升高，IL-10 下降可能与IL-27 的调节有关。IL-27 对Th17/Treg 的调节机制尚不明确，有研究认为IL-27因子对Treg 和Th17 分化均有抑制作用，其中通过STAT1通路抑制Th17，而对iTreg细胞的抑制作用与STAT1 通路无关［11］。另一研究得出不同结论，认为IL-27能增强Treg的稳定性，减轻炎症反应［25］。在其他免疫类疾病中，IL-27 对Treg/Th17 的影响也会导致疾病的发生，在胶原诱导性关节炎中，IL-27 因子通过影响 IL-17、RORt、STAT3 的基因表达，影响Th17 含量。IL-27 可能主要通过增加CTLA4+含量，增强对Treg的抑制作用［37］。

3.3.3 其他细胞因子 除上述细胞因子之外，其他因子对Th17/Treg 平衡的影响也会导致病理妊娠的发生。CTLA-4 和免疫检查点蛋白Tim-3 的阻碍作用不利于正常妊娠，易导致胚胎的吸收，受孕数下降，正常妊娠中会阻碍Treg 相关的调节保护作用。与正常妊娠相比，在URSA 中，dCD4+T 细胞中CTLA-4和Tim-3呈现出低表达趋势，同时，dCTLA-4+Tim-3+CD4+T细胞低表达Treg相关细胞因子，提示流产的发生［38］。在小鼠模型中，NLRP3（NACHT、LPR and PYD domains-containing protein 3）呈现出高表达特征，Th17 释放促炎因子IL-17，对于炎症体NLRP3的表达呈相关，而Treg 的表达会抑制NLRP3 表达，在正常妊娠过程中起到免疫耐受作用［1］。促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）能调节Th17/Treg 平衡，在不明原因胚胎种植障碍的患者中，GnRHa 能有效减少Th17含量而增加Treg含量，改善内皮容受性［39］。IL-10作为免疫系统重要的抗炎因子，是Treg调节妊娠过程免疫耐受的重要部分，IL-17A 则是由Th17 产生的，介导众多炎症发生的促炎因子，在URSA 患者的蜕膜和外周血中，IL-10 水平随Treg 水平下降，而IL-17A水平随Th17水平而上升［14］。

3.4 免疫抑制分子参与调节Th17/Treg 平衡 程序性死亡受体1/程序性死亡配体1（programmed cell death-1/programmed cell death-ligand 1，PD-1/PD-L1）在调节Th17/Treg 平衡中具有重要作用。在淋巴细胞减少诱导的新近胸腺迁出患者中，PD-1 的表达缺失并不会阻滞Treg 磷酸化过程，相反磷酸化的Treg 细胞数量增多，提示Treg 免疫功能障碍可能是通过PD-L1 表达进行调控，而PD-1 并不影响Treg产生［40］。在正常妊娠中，PD-L1 的缺失增加胚胎的吸收率，增加了滤泡调节性细胞（T follicular regula⁃tory，Tfr）的比例，同时提高了 PD-1 的表达水平［41］。PD-1 对于妊娠而言是重要的免疫调节因子，阻断PD-1时，不仅会使小鼠流产率增加，还会加重CD8+T细胞的功能障碍［42］。妊娠期高血压患者中，Treg 相关因子Foxp3 含量减少，PD-1/PD-L1 通路的激活因子PD-L1-Fc 能促进Treg 的分化，增加Treg 细胞因子含量［43］。先兆子痫患者中 Treg 表达减少，Th17 和PD-1 表达增加。PD-L1-Fc 通过PI3K/AKT/mTOR通路影响 Treg/Th17 及 Foxp3 和 RORt 含量［44-45］。与病理妊娠类似，PD-1/PD-L1 对Th17/Treg 的调节也可能影响其他免疫性疾病的发生，在早期RSA 和新近胸腺转移模型中，PD-1 抑制剂（PD-1 blockade）能抑制吞噬细胞的活性，提高促炎因子表达，CD4+T 细胞比例上升，但CD4+CD25+Treg 比例变化不大，提示PD-1 主要抑制T 细胞的生长，而非促进Treg 的繁殖［40，46-47］。在肠梗阻患者中，PD-1 表达的升高与肝Th17增多有关，对提高肝Treg细胞数量意义不大［48］。

4 URSA中Th17/Treg免疫调节的相关治疗

4.1 淋巴细胞免疫治疗 临床上对于URSA 的治疗往往以恢复Th17/Treg 平衡，进而恢复母体和胎儿的正常免疫功能为主要方向。淋巴细胞免疫治疗，通过父方或第三方的淋巴细胞来抑制母体免疫系统对胎儿的反应，实现妊娠。其中，淋巴细胞免疫疗法能显著减少Th17 和细胞因子水平，导致Foxp3 和 Treg 细胞因子增加，例如 IL-10、TGF-β 等，有助于成功妊娠［49］。在妊娠过程中，不同部位的淋巴细胞呈现不同特点，其中与子宫内膜和外周血相比，足月壁蜕膜中分化的Treg 数量明显增加，提示Treg对妊娠过程中的耐受环境的促进作用［50］。

4.2 人绒毛膜促性腺激素和免疫球蛋白治疗 人绒毛膜促性腺激素和免疫球蛋白治疗URSA 中，治疗后患者外周血中Th17 数量减少，Treg 数量增加，同时 Th17 相关细胞因子 IL-17、IL-6 等减少，Treg 相关细胞因子IL-10、TGF-β 等增加，利于妊娠状态的维持，说明URSA 与Th17/Treg 的失衡相关，恢复Th17/Treg 平衡对于重建母胎免疫耐受，治疗URSA至关重要［51］。

4.3 其他 在正常妊娠过程中，褪黑激素具有免疫调节的重要作用。血清中的褪黑激素在孕晚期会上升，伴随Treg 及细胞因子TGF-β 含量的上升和Th17 数量的下降［52］。也有研究通过特异的组蛋白去乙酰化酶抑制剂进行体外CD4+CD25+T 细胞表观Foxp3 基因的遗传修饰，在动物模型中进行RSA 的免疫调节治疗，结果显示CD4+CD25+Foxp3+iTreg 及PD-1 和CTLA-4 基因高表达，相关细胞因子TGF-β和IL-10 水平提高，进而提升易流产体质鼠脾中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量，减少胚胎吸收率［53］。

5 总结

妊娠是一个较为复杂的过程，胚胎的植入伴随着母胎免疫耐受中诸多免疫细胞和免疫因子表达水平和含量的变化，以维持正常健康的妊娠环境。T 淋巴细胞、NK 细胞等具有调节妊娠微环境的作用，Th17/Treg等平衡的改变对母胎免疫耐受的影响至关重要，基因的过表达或低表达、平衡偏倚、细胞数量的变化都会导致妊娠环境的改变，是诱导UR⁃SA 等病理妊娠的重要因素［19］。在研究 URSA 的过程中，Th17/Treg 平衡并不是唯一影响因素，同样不仅有唯一机制对平衡造成改变而导致疾病的发生，多因素影响下所见的只是宏观的变化，微观之下的调节会更为精细而复杂。在研究URSA 的道路上，仍有很多的工作尚未完成。