肿瘤细胞利用Notch信号形成促癌细胞因子微环境的研究进展①

古心怡 温俊杰 宁云山③ 李 妍③ （南方医科大学第一临床医学院，广州510515）

Notch 信号是一种高度保守的信号通路，参与细胞生长、分化等过程，由受体（Notch1-4）和配体（Jagged1-2 和Dll1-3-4）组成。配受体结合后，Notch蛋白被水解成胞内段（intracellular domain，ICN）进入细胞核并作用于由RBP-Jκ、MAML1-3 与其他转录相关蛋白组成的转录复合体CSL，调控下游靶基因如Hes1 等的转录。 Notch 信号通路也参与调控肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用，影响细胞因子调节网络与免疫系统功能，介导肿瘤的发生发展。展示了近年来Notch 信号对细胞因子微环境和免疫系统的影响（表1）。本文将重点探讨Notch 信号通路异常激活形成的肿瘤微环境（tumor microenviron⁃ment，TME），以及其中各类细胞因子对肿瘤发生、发展、衰老、转移及免疫反应产生的影响。

表1 Notch信号在细胞因子微环境与免疫系统中的作用Tab.1 Effects of Notch signaling on cytokine milieu and immune system

1 Notch 信号通路促进肿瘤相关炎症细胞因子的分泌并形成免疫抑制微环境

TME 中存在大量的炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β 等，它们构成复杂的细胞因子网络，调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等，促进肿瘤的发生发展［28］。而Notch 信号在其中起到重要的调控作用，并参与免疫抑制微环境的重构。

1.1 TNF-α TNF-α 是 NF-κB 通路的强效激活因子，促进Notch相关肿瘤疾病的发生发展［33］。TNF-α激活IκBα 通路，使转录因子FOXA2 磷酸化失活，抑制Notch 阻遏蛋白Numb 的表达，从而解除对Notch的阻遏，并激活该通路［34］。TNF-α 还通过激活IκBβ通路，促进 RBP-Jκ 与 Hes1 基因表达，并抑制抗炎因子PPARγ 的作用，同时募集巨噬细胞与中性粒细胞于癌灶局部释放 TNF-α、IL-6 与IL-1β，引发炎症反应，诱发炎症相关肿瘤疾病如肝癌等［34-35］。TNF-α还作为反式作用因子激活MDCS 的p65 通路，上调Jagged1/2，介导MDCS 产生癌抗原耐受，削弱CD8+T细胞杀伤作用［36］。此效应在 Lewis 肺癌、结肠癌、胸腺瘤与黑色素瘤的小鼠肿瘤模型都有典型表现。而在多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中，Notch与TNF-α 相互作用将导致溶骨。MM 细胞与骨细胞共培养，二者Notch 信号均会激活，骨细胞会发生凋亡，而MM 细胞活性增强，分泌大量TNF-α，加快骨细胞凋亡进程。仅下调TNF-α 只能延缓骨细胞凋亡进程，而同时阻断Notch 信号则能完全逆转其凋亡，延缓MM发展［37］。

1.2 IL-1β 促炎因子IL-1β主要由巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞在急性炎症反应时分泌，引起机体发热与全身性炎症反应。而肿瘤病灶的IL-1β 主要由癌细胞、TAMs 与脂肪细胞产生，其分泌由Toll样受体启动，受Notch 信号调控。IL-1β 具有抗癌与促癌的双重效应，其偏向性取决于不同的肿瘤环境［15，38］。Notch 与 IL-1β 相互作用能诱导肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）自我更新。如三阴性乳腺癌脑转移后，癌细胞高水平的IL-1β 会促进邻近星形胶质细胞高表达Jagged1，激活CSCs 的Notch 信号，促进CSCs 自我更新［39］。在基底样乳腺癌中，Jagged1 激活的肿瘤细胞释放ICN1 与ICN3，作用于Notch 基因转录起始位点上游 2 085 bp 的 RBP-Jκ 序列，促进IL-1β 分泌，间接提高CCL2 水平，募集肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）及单核细胞于肿瘤病灶，形成免疫浸润，导致不良预后［15，40］。

1.3 TGF-β TME 中间质细胞与 Jagged1 激活的肿瘤细胞均会产生TGF-β，维持微环境中IL-1β 与CCL2含量，募集单核细胞，形成免疫浸润，促进肿瘤产生耐药性并发生上皮细胞-间质转化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）。研究表明，Notch 信号能作用于 Th17、Tregs 与 DCs，从而调控 TGF-β 水平。骨肿瘤细胞的Jagged1/2 与Notch1/2 结合激活Notch信号，使ICN入胞结合Smad3蛋白后共同进入细胞核，在RBP-Jκ 的参与下促进Hes 基因表达RANKL，作用于 DCs 和单核细 胞［41］。肿瘤细胞Notch 信号激活还可使其高表达TGF-βR1，提高TGF-β 敏感性［15］。在尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator，uPA）的作用下，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）分泌的高水平TGF-β 结合肿瘤细胞TGF-βR1，会促进肿瘤细胞增殖与肿瘤发展。综上，Notch信号调控TGF-β水平，将促进骨肿瘤等其他肿瘤疾病的发生发展。

1.4 IL-6 肿瘤细胞与肿瘤间质细胞均能分泌高水平IL-6，并与Notch相互作用，重构机体免疫环境，提高肿瘤耐药性、侵袭力与增殖力，导致不良预后［11-12，42-44］。上述效应在 MM 与乳腺癌中最为典型。TME中的肿瘤细胞高表达Jagged1/2与Notch3，前者结合间质细胞受体，后者则结合其他肿瘤细胞配体，导致两种细胞分泌高水平IL-6，激活非经典Notch 信号，维持肿瘤干性。另外，骨髓来源的抑制性 细 胞（monocyte-myeloid-derived suppressor cell，MDSC）会同时分泌IL-6 与NO，二者均会激活肿瘤细胞 Notch 信号：IL-6 促进 STAT3 与 ICN 结合，正向提高IL-6 水平；而NO 则维持STAT3 水平，起到维持肿瘤细胞干性，使其稳定传代的作用［13］。

1.5 IL-4 IL-4 基因3'端下游的保守区非编码序列-2 位中存在两个 Notch/RBP-Jκ 结合位点，提示Notch信号可直接调控IL-4分泌，并与IL-4存在相互作用［45］。Notch 与 IL-4 相互作用可促进 DCs 成熟与分化：Dll4 激活巨噬细胞Notch 信号后，促进其分泌IL-4，为DCs 成熟与分化提供必要条件。若缺乏IL-4，Jagged1激活DCs后反而抑制其成熟，使幼稚细胞大量聚集［10］。Notch 与 IL-4 相互作用还能促进Th2 分化：DCs 的 Jagged2 激活 T 细胞 Notch，在 IL-4存在下可使其分化为Th2，GATA3 在其中起到关键作用，IL-2/IL-2Rα 也参与其中［46］。另外，Notch 信号激活能抑制M2 分化，并使成熟的M1 凋亡，这可能与Hes1蛋白结合STAT3后抑制IL-4R通路有关［22］。

1.6 IL-10 IL-10 由TME 中的肿瘤细胞与免疫细胞如Th1 等分泌，其含量高低将决定肿瘤疾病的严重程度。Th1 在IL-12 或IL-27 的作用下，或经DCs的Dll配体激活后，会高表达IL-10，起到抑制自身活性的作用［19］。最近研究表明，Notch-IL-10 调节轴激活能防止肝炎发生。肝窦内皮细胞Dll 和Jagged 配体会激活Th1 的Notch 信号，提高Th1 靶基因Hes1与Deltex-1 表达水平，进而促进IL-10 分泌而抑制肝细胞炎症反应［18］。而 Notch 受体缺陷的 CD4+T 细胞则无法分泌IL-10 防止肝炎发生。Th1 通过Notch-IL-10 调节轴促进 TAMs 与 M2 向 M1 分化，成熟后的巨噬细胞分泌 TNF-α 与 IL-12，抑制 IL-10 与 TGF-β分泌，发挥强大的抗癌作用［30］。用 GSI 和 siRNA 阻断Notch 或敲除巨噬细胞RBP-Jκ，则会使TAMs 分化为M2，分泌IL-10而抑制Th1活性［32］。

1.7 IL-17 IL-17 主要由Th17 细胞产生，也可由CD8+T 细胞、γδT 细胞、NK 细胞与中性粒细胞产生，主要激活NF-κB 通路，诱导各种促炎因子与趋化因子分泌，募集单核细胞与中性粒细胞，引起局部炎症反应，这与癌症的发生密切相关［47-49］。在不同免疫环境中，Notch 与IL-17 共同发挥抗癌作用。病原激活 DCs 的 TLR 通路，上调其 Dll4，激活 Th17 的Notch1，使其表达启动子Ror-γt，反式激活靶基因表达，促进其分泌更多IL-17［50-51］。而CD4+T细胞Notch激活后会分泌 TGF-β 与 IL-6，促进 Th17 分泌 IL-22与IL-23，从而与IL-17 共同发挥抗癌效应。Jagged1激活DCs 的Notch 信号后促进其高表达IL-2，促进CD25+分泌 IL-17［52］。Notch 还参与 γδT-17 在胸腺与外周免疫器官内的成熟［23］。IL-6使胸腺上皮细胞高表达 Dll4 配体，激活 γδT-17 的 Hes1 基因表达，促进其胸腺成熟［23］；IL-6 还会募集中性粒细胞与单核细胞，促进炎症反应，发挥促癌作用［53-55］。另外，肠道与肺内的外周免疫组织细胞也能高表达Dll4 激活γδT-17 的 Notch 信号，促进其外周成熟，并分泌 IL-17和IFN-γ，与TNF-α共同发挥抗癌作用［7，23，51］。

1.8 CCL5 TME中的CCL5由浸润性白细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cells）或肿瘤相关成纤维细胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs）产生，具有促癌作用。MM 的骨髓间充质干细胞和乳腺癌细胞高表达的CCL5 激活TAM 的Notch 信号后使其分化为M2，引发EMT；还会促进其产生更高水平CCL5，激活癌细胞AMPK 通路，增强糖酵解代谢，产生大量乳酸［56-57］。Notch 信号与 CCL5 的相互作用会导致几种结果：第一，募集TAM 并促进癌转移；第二，高浓度乳酸与低浓度葡萄糖影响T细胞代谢，抑制其增殖与活化并诱导其凋亡，同时使浸润性T 细胞分化为细胞毒性T细胞；第三，对于不依赖葡萄糖代谢的Tregs细胞，其数目反而增加［58］。

1.9 CXCL12 CXCL12 也称为间质细胞衍生因子1（stromal-derived factor 1，SDF1），结合 CXCR4 或CXCR7 受体后介导相关趋化因子分泌。血液系统肿瘤如MM 中，Notch 信号激活后，水解的ICN 可作为反式激活因子上调CXCR4 基因表达水平［25］。而CXCR4 基因缺失的鼠造血祖细胞中，ICN1 促进CX⁃CR4 表达将导致白血病发生［59］。Notch 与 CXCL12/CXCR4 能够协同构造以Tregs 与M2 等细胞为主的免疫抑制型肿瘤微环境。二者相互作用会募集前体单核细胞，并促进前体单核细胞分化为M2。因而骨髓瘤患者M2的CXCR4水平远高于正常人［26］。目前已证实，Notch1 在B 细胞慢性淋巴瘤中能直接促进CXCR4 表达，其他血液系统恶性肿瘤如T-ALL 需同时激活CXCR4 通路与Notch1 才能提高CXCR4 水平［60］。Notch 与 CXCL12/CXCR4 的协同作用在卵巢癌与肝癌等实体瘤中亦有典型表现，用DAPT与CX⁃CL12/CXCR4 抑制剂可阻断此效应［28］。DAPT 阻断Notch 后会下调 CXCR4 与 CXCL12 水平，使 Tregs 细胞减少，IFN-γ+/IL-10+CD4+与 CD8+细胞增加，打破免疫抑制型肿瘤微环境，恢复机体适应性免疫力，增强抗癌能力。

2 Notch信号与IFN-γ相互作用调节免疫细胞功能

IFN-γ 与 Notch 相互作用在 DCs，CD8+T，CD4+T和 NK 细胞中有明显表现。Notch 与 IFN-γ 相互作用促进DCs成熟，提高其诱导T 细胞生长分化的能力，发挥重要的抗癌作用［61］。DCs的Jagged1型Notch 激活后，在CD80/CD86 与PI3K 通路的参与下逐步成熟，分泌 IL-12 与 IL-6，其中 IL-6 为激活多种 T 细胞亚型的必要条件［62］。而 Notch 会阻断 IFN-γ 对 Th2的诱导作用，促进T 细胞向Th1 分化。MAML-/-转基因小鼠模型证明，Notch 激活的DCs 能诱导CD4+向 Th1 分化，但若缺乏 IFN-γ，即使 Notch 处于激活状态，诱导也无法实现［6，63］。这可能由于ICN含量过低，无法充分激活 IFN-γ 基因的 RBP-Jκ 增强子元件［62-63］。因此，T细胞分化为Th1需要IFN-γ与Notch的共同参与。DCs 的 Dll4 或 Jagged1 激活 CD8+T 细胞的Notch2，是CD8+T细胞分裂与活化的前提，也是细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12、穿孔素和颗粒酶B分泌的条件［4-5］。Notch 对 CD8−DC 与 CD8+T 的作用有所不同。在LPS 的诱导下，前者表达MyD88 依赖性Dll4，激活 Notch 信号，促进 Th1 分泌 IFN-γ。小鼠淋巴瘤模型等相关体内外实验表明，GM-CSF 与CpG DNA 能够促进 DCs 表达 Jagged2。另外，DCs 还表达Dll配体，与表达Jagged2和Dll配体的巨噬细胞共同激活 NK 细胞的 Notch2，促进 NK 成熟，分泌 IFN-γ，并增强其细胞毒性，并发挥重要的抗癌作用［18，64］。

3 Notch 信号与IL-1β、CCL2相互作用介导免疫浸润

Notch 信号在TME 中会促进肿瘤细胞分泌CCL2。在实验诱导型肝纤维化与慢急性肝衰竭中，此效应由 Dll4 激活［65］；而在其他肿瘤疾病中，则由Jagged1激活［16］。肺癌疾病中，纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞和平滑肌细胞均产生高水平CCL2，募集单核-骨髓源性免疫抑制细胞（monocyte-myeloid-de⁃rived suppressor cells，Mo-MDSCs）与巨噬细胞，促进肿瘤发展与转移，而肿瘤抑制因子FBXW7 能降解ICN 与相关癌基因，延缓肿瘤进展，但由于其水平较低，不能充分发挥作用［3］。肿瘤源性miR-146a 激活骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）Notch1，促进除CCL2 以外的多种细胞因子如IL-8、IL-6、CXCL1、CCL5、IL-10 的分泌，加快肿瘤进展［56］。而黑色素瘤中，沉默Notch 共激动因子MAML1 的黑色素瘤细胞M624 可分泌更高水平CCL2［66］。CCL2会与 Notch 共同促进肿瘤发展，而肥胖患者有典型表现，这与他们的代谢状况、激素水平和leptin 含量有关［15］。罹患乳腺癌的肥胖患者体内高水平 leptin 可激活Notch、JAK2/STAT、MAPK1/2K 1/2与PI3K/AKT几种通路，提高IL-1β水平［67-68］。

4 Notch 信号与VEGF 相互作用诱导血管生成与肿瘤浸润

TME 中肿瘤细胞与间质细胞分泌的VEGF 会诱导血管新生，为肿瘤细胞生长提供氧分与转移渠道，而Notch 信号在其中起到重要作用。新生毛细血管由前端细胞与茎细胞组成，它们的比例将直接影响新生毛细血管的出芽与成熟。乳腺癌小鼠移植瘤模型中，关键分子leptin 与IL-1 共同促进癌细胞分泌VEGF，激活前端细胞VEGFR2/3 与Nrp1 受体后，前端细胞Dll4激活茎细胞Notch1，上调茎细胞VCAM1，有利于中性粒细胞浸润和肿瘤细胞的血道转移［67，69］。前端细胞 Dll4 还会促进自身向茎细胞分化，下调前端细胞/茎细胞比例［70］。茎细胞Notch 激活后，下调VEGFR1/2/3 或促进sVEGFR 分泌，中和VEGF，降低环境中VEGF水平，减缓血管生成。

多发性骨髓瘤中，BMSC 的Jagged2-Notch 信号激活会促进MM 细胞分泌VEGF，上调前端细胞Dll4，激活茎细胞Notch 信号，促进茎细胞增殖［71-72］。在神经胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、纤维肉瘤、胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺肿瘤小鼠病理模型中，若阻遏Notch信号，则诱导血管内皮高表达VEGFR，增加血管分支密度，降低每条分支的血流灌注量造成缺氧，抑制肿瘤生长。结肠癌小鼠肿瘤模型中，VEGF上调CD8+的PD-1，产生免疫抑制，而VEGF-A-VEG⁃FR 抗血管生成药可靶向阻断此效应［73］。在神经系统肿瘤如多形性胶质母细胞瘤中，癌细胞VEGF-C/VEGFR3 通路与Notch 信号相互作用还能介导癌灶淋巴管的形成，为肿瘤淋巴转移提供条件［74］。因此，阻断Notch 信号或VEGF 通路能发挥靶向抗癌效应。

对于结直肠癌与急性T 淋巴细胞白血病，Dll4则激活肿瘤细胞Notch3，打破肿瘤细胞休眠状态，使肿瘤细胞重获增殖力［75］。 目前，人们对Notch 和VEGF 诱导肿瘤血管生成的作用研究较为透彻，但对二者能终止肿瘤休眠的机制却所知甚少，推测可能与VEGF 和Notch 降低T细胞免疫监视功能，打破肿瘤细胞休眠状态相关［24］。

5 Notch 信号调控衰老相关细胞因子分泌并介导免疫抑制

Notch 还参与细胞应激反应如DNA 损伤或原癌基因激活，使肿瘤细胞丧失永生化特性与增殖能力而衰老，但仍保留代谢活性与分泌一些细胞因子的能力。衰老的肿瘤细胞仍能募集免疫细胞，发挥免疫清除功能，有时也会促进毗邻的非衰老细胞增殖，营造免疫抑制环境，抑制抗癌作用，加快肿瘤进展。

RBP-Jκ 是 p53 基因的阻遏蛋白，p53 与衰老相关基因p21和促炎因子基因具有相同调控位点。若敲除真皮、口腔粘膜、乳腺和肺组织内原始的肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的RBP-Jk 基因，会导致肿瘤细胞衰老［76］。Notch1，Notch3 分别与 Jagged1 结合后也能导致肿瘤衰老，其中以Notch1 产生的效应最为典型［77］。衰老途径有多种，但都要经历两个特殊复杂的阶段。第一阶段称为Notch 诱导型细胞衰老（notch-induced senescence，NIS），分为癌基因诱导型衰老（oncogene-induced senescence，OIS）与DNA损伤型衰老（DNA damage-induced senescence，DDIS）。高水平TGF-β 能抑制CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer-binding protein β，C/EBPβ）转录活性，进而抑制促炎细胞因子分泌，影响淋巴细胞黏附与溢出功能，削弱抗癌能力，形成免疫抑制环境。若ICN1 水平异常提高会使p16INK4A 高表达，p21 和Rb 去磷酸化，细胞周期将永远停留于G0/G1期，导致细胞停止生长而衰老［78］。进入第二阶段，癌细胞完全衰老，Notch 表达则回到基准水平，C/EBPβ 活性恢复，形成衰老相关分泌表型（senes⁃cence-associated secretory profile，SASP）［77］。综上，两种不同的Notch 水平，对应两种衰老时相细胞因子的分泌：衰老第一阶段，以抗炎细胞因子为主，而第二阶段，在Notch1与C/EBPβ的相互作用下，则以促炎细胞因子与基质重构酶（MMP1、3、10）为主［77］。

尽管Notch 与其他通路的相互作用导致细胞衰老的机制仍未全部阐明，但其介导衰老相关TME，影响抗癌免疫的效应却已明晰，这为Notch 信号靶向抗癌疗法奠定基础。

6 结论与展望

细胞因子调节网络在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，一些信号通路如Notch 信号的异常激活将导致肿瘤细胞与细胞因子调节网络发生异常的相互作用，产生多种复杂的免疫反应，甚至重构患者的免疫环境［79］。针对这些信号通路的靶向疗法理论上可恢复正常免疫环境，提高治愈率与患者生存率。目前，阻断Notch 信号的靶向疗法大多依赖GSI 但由于缺乏针对性，容易产生胃肠道毒副作用，导致胃黏膜肠上皮化生，因此该应用受到限制。但如今已有Notch1、Notch2/3 和Dll4 单抗药物与小分子Jagged1/2靶向药物问世，这些药物能特异性抑制Notch 信号，减轻副作用［80-84］。但大多数肿瘤发病机制并非单纯依赖一条信号通路，如Notch 信号会联合NF-κB、CXCR4/CXCL、STAT 等其他相关通路发挥作用，共同导致肿瘤发生。因此，攻克肿瘤道阻且长，而机制的阐明为抗癌第一关，鉴于Notch 信号对细胞因子网络的调控作用，未来可以针对其进行抑制，从而干预其介导的肿瘤增殖、侵袭、转移和血管生成，为肿瘤治疗提供潜在的治疗靶点。