无菌小鼠在肠道菌群研究中的应用概述*

涂师运， 王 娟， 傅金凤， 盛 鸥

（1华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州510641；2广东省农业科学院果树研究所/农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室/广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广东广州510640）

人类胃肠道中有10～100 万亿微生物，这些微生物归属于9 个细菌门，其中厚壁菌门和拟杆菌门微生物占了绝大多数［1-3］。近年来，越来越多的研究证实，肠道菌群与肥胖相关疾病、心血管疾病、代谢性疾病、肝病、炎症性肠病和结直肠癌存在联系，并在调节胰岛素敏感性、脂肪储存和体重方面发挥关键作用［4-8］。在人体中，与基因相比，肠道菌群更具可塑性，其组成随年龄和饮食等因素而变化，因此有可能通过调节肠道菌群的组成来预防和治疗疾病。总的来说，肠道菌群的研究对维护人类健康具有重要意义。

由于肠道微生物数量庞大，情况复杂，因此在许多疾病中肠道微生物对疾病的驱动机制仍不清楚［9］，这对构建特定疾病的肠道菌群模型造成了阻碍。无菌鼠是进行肠道菌群研究的有效工具，无菌鼠的使用为解决该难题提供了处理方法。本文对无菌鼠（主要是无菌小鼠）在肠道菌群研究中的应用进行综述，为相关科学研究提供参考。

1 无菌鼠的概况

1.1 无菌鼠的特点 无菌鼠是指无细菌、病毒、真菌、原生动物和其他腐生或寄生相关生命形式的鼠（大鼠或小鼠）［10］。这类鼠是在无菌条件下人工剖宫产获得的子代鼠，再放在无菌隔离系统内用人工喂乳或无菌“奶妈”鼠代乳饲育而成［11］，其无菌性可通过需氧、厌氧粪便培养及粪便样品聚合酶链式反应筛选16S RNA来确认［12］。

1.2 无菌鼠相对于普通动物实验的优势 无菌鼠由于其自身的特殊性，可用于制造人源化小鼠或被移植特定肠道菌群，在进行特定肠道菌群特性研究、肠道菌群作用机制研究，以及功能性食品、药品开发方面具有独到优势，而普通实验动物不具有这种优势。

1.3 无菌鼠实验的要求 无菌鼠实验自上个世纪就已经存在。1946 年，Gustafsson 首次报道了人工饲养无菌鼠的情况［13］。理论上，无菌鼠模型可由任意品系鼠建立，其中较为常用的大鼠品系包括F344、Wistar 和Sprague-Dawley 等，较为常用的小鼠品系包括C57BL/6、BALB/c、Swiss Webster、Kunming 和ICR等［14］。

无菌鼠需要在无菌条件下饲养，最初的隔离器是由不锈钢制成的，非常沉重、昂贵而且不灵活，如今一般采用柔性薄膜隔离器。无菌鼠的食物、水和用品都需要使用高压灭菌钢瓶消毒，对于热敏性药物以及有特定补充剂的药物则先经辐射杀菌，经无菌过滤到无菌试管中，再用Clidox“雾化”后导入隔离器。在操作过程中应注意：（1）彻底地计划实验，防止隔离器开口影响无菌环境；（2）每周监控隔离器，防止人员违规操作，注意手套磨损和过滤器积灰；（3）将无菌鼠菌株保存在多个隔离器中，以防隔离器受到污染；（4）不在隔离器中引入设备，不让除高压灭菌用品外的用品进入繁殖隔离器，避免在繁殖隔离器之间传递动物和材料，以保护无菌环境［15］。

2 用无菌鼠实验研究不同生理病理状态下的肠道菌群状况

2.1 不同年龄肠道菌群的变化 在不同的生命周期中，肠道菌群随着宿主生命周期的变化而变化，越来越多的人意识到肠道菌群是促进机体发育和稳态的重要生理因素［16］。在半超级百岁老人（semi-super⁃centenarians）的肠道微生物群中，发现了特别的微生物状态，这些人群中的健康菌落——包括Akkerman⁃sia、Bifidobacterium和Christensenellaceae在内的数量高于常人［17］。该研究表明，老年群体的肠道中存在优势菌群。

Kundu 等［18］将健康的老年（24 月龄）小鼠和年轻（5～6 月龄）小鼠的肠道微生物移植到年轻（5～6 周龄）无菌小鼠中，对比二者发现接受老年小鼠肠道菌群的无菌小鼠显示出许多差异，包括海马神经元双皮质醇阳性水平增加，肠道表面积增加，肝脏应激抵抗力、丁酸盐和多倍体激素成纤维细胞生长因子21表达的增加。Fransen 等［19］将肠道菌群从年轻（11～14 周龄）或老年（18 周龄）常规饲养小鼠移植到年轻（12～14 周龄）无菌小鼠中，四周后处死无菌小鼠，采用流式细胞术对各组进行分析，结果表明，常规饲养小鼠中，相对于年轻小鼠，老年小鼠脾脏中Th2 细胞的频率更高，并且这种Th2 细胞频率的增加可以通过将常规饲养老年小鼠的肠道菌群转移到年轻无菌小鼠来诱导，而转移常规饲养年轻小鼠的肠道菌群时没有观察到诱导效果。STRING 数据分析显示，与常规饲养的年轻小鼠相比，在常规饲养的老年小鼠回肠中高表达的基因是一大群包括抗原处理和递呈、补体途径激活、微生物相关分子模式识别及B 细胞迁移功能的基因。并且，年龄影响厚壁菌门/拟杆菌门比值（Firmicutes/Bacteroidetes，F/B），老龄鼠体内拟杆菌门更多，厚壁菌门更少。Yang 等［20］的研究指出，由厚壁菌门增加或拟杆菌门减少引起的F/B增加被广泛认为是肠道生物失调的标志。可以看出，机体在不同年龄段的肠道菌群组成不同，老年小鼠肠道菌群相对于年轻小鼠具有更多优点。

2.2 肥胖与肠道菌群的关系 肥胖是指身体脂肪含量过高，导致体重增加的现象，许多疾病与肥胖有关［21］。自1980 年以来，70 多个国家的肥胖率翻了一番，其他大多数国家的肥胖率也在不断上升；至2015年，全球共有1.077 亿儿童和6.037 亿成人肥胖。高体质量指数（body mass index，BMI）导致全球400 万人死亡［22］。Bäckhed 等［23］将传统饲养小鼠盲肠微生物移植到同型无菌小鼠中，在14 d 内减少了其进食量的情况下，无菌小鼠却表现出体脂含量增加的现象，表明微生物能促进肠道对单糖的吸收，并且无菌小鼠在被移植菌群后，其空腹诱导脂肪细胞因子的作用被选择性抑制，导致脂肪细胞中甘油三酯增加，说明肠道菌群与机体肥胖存在关联。Ridaura 等［24］将4 对肥胖程度不一致的双胞胎（肥胖的一方BMI＞30 m/kg2，且两个双胞胎常年BMI 相差≥5.5 m/kg2）的粪便样品以经口灌胃的方式移植到无菌小鼠中，发现移植了双胞胎中肥胖一方肠道菌群的无菌小鼠脂肪质量的增大趋势显著大于移植了较瘦一方双胞胎肠道菌群的无菌小鼠，表明肥胖人群的肠道菌群更有利于肥胖体质的形成。Ley 等［25-26］的研究表明，在瘦型和胖型小鼠中，拟杆菌门和厚壁菌门的比例不同；胖型小鼠拟杆菌门少而厚壁菌门多，经低碳水化合物饮食治疗后，表现出拟杆菌门丰度增加而厚壁菌门丰度减少。这些研究表明，肥胖机体具有特殊的肠道菌群，其肠道菌群对于肥胖体征的形成具有促进作用，通过饮食治疗可以调整肠道菌群构成。

2.3 高血压与肠道菌群的关系 有研究表明，与常规鼠相比，肠道菌群完全不存在的无菌小鼠的血压相对较低［27］。Li 等［28］将高血压患者的肠道菌群移植到无菌小鼠中，通过尾部套袖法测定血压值，结果表明，与对照组相比，移植了高血压患者肠道菌群的无菌小鼠显示出更高的收缩压、舒张压和平均舒张压。为了确定肠道微生物的变化是否与高血压有关，他们还对41名健康对照、56名高血压前期患者和99名原发性高血压患者进行粪便样品研究，通过从这些样本中识别的基因总数来表征肠道菌群的丰富度，发现高血压前期患者组和高血压患者组的基因数量明显减少，表明高血压患者存在肠道菌群密度低的状况。对Wistar Kyoto 大鼠［平均动脉压为（108±2）mmHg］和自发性高血压大鼠［平均动脉压为（148±10）mmHg］从Chao 丰富度、Pielou 均匀度和Shannon多样性进行粪便细菌群落组成分析，发现自发性高血压大鼠组的F/B 比Wistar Kyoto 大鼠高约5 倍，并且微生物丰富度、均匀度和多样性都显著下降［20］。因此，肠道菌群与高血压症状存在关联，高血压机体的肠道菌群存在异常。

3 肠道菌群影响疾病发生发展的作用机制

3.1 影响基因的表达 近年来，许多研究利用无菌鼠证实了肠道菌群与癌症存在关联［29-30］。结直肠癌（colorectal cancer，CRC）为全球发病率第3、死亡率第2 的癌症。CRC 的发生、发展和治疗与多种因素有关，其中肠道菌群紊乱可能起着一定的作用［31］。Sobhani 等［32］先将无菌小鼠分为4 组，1、2 组接受CRC 患者肠道微生物移植，3、4 组接正常人体肠道微生物移植，再让1、3 组接受致癌物氧氮甲烷，2、4 组接受作为对照的生理盐水。结果显示，接受氧氮甲烷影响并移植了CRC 患者肠道菌群的无菌小鼠表现出比移植正常肠道微生物的无菌小鼠更低的平均体重。已知聚乙二醇可以阻断肠道菌群定植，如果在小鼠饮水中加入聚乙二醇，则这种体重下降的现象消失了。同时，移植了CRC 患者肠道菌群的无菌小鼠结肠黏膜中SFRP1、SFRP2、SFRP3、PENK、NPY、ALX4、SEPT9和WIF1等基因启动子被发现高度甲基化。由此可以得出结论，移植CRC 患者肠道菌群可诱导了机体CRC 相关基因启动子的甲基化。

Manca 等［33］利用无菌小鼠研究了肠道菌群对内源性大麻素组（endocannabinoidome，eCBome）的影响。内源大麻素系统由天然配体N-花生四烯醇乙醇胺和2-花生四烯醇甘油、它们的生物合成和降解酶以及大麻素受体组成，是一个广泛分布的传输器系统，通过外围和中央控制肠道功能［34］。eCBome是一个复杂的信号系统，包括内源性大麻素系统、大约50 种受体和代谢酶，以及超过20 种具有重要生理病理功能的脂质调节剂（调节胃肠道功能），并可能介导宿主细胞的微生物通讯［33］。Manca 等［33］将12 周龄无菌小鼠随机分为两组，一组接受传统饲养小鼠的粪便微生物移植（fecal microbial transplanta⁃tion，FMT），另一组以无菌PBS 灌胃，将两者与普通无菌小鼠、传统饲养小鼠在第4 和13 周观察对比编码eCBome 受体的基因Cnr1、Gpr18、Gpr55和Ppara，发现：第13 周时Cnr1在普通无菌小鼠回肠中的表达增加了近2 倍，而FMT 部分逆转了这种变化；对于两个孤G 蛋白偶联受体Gpr18 和Gpr55，FMT 显著逆转了二者在回肠中以及Gpr55 在十二指肠中表达的降低。因此，肠道菌群能够影响基因的表达，进而影响eCBome。以上研究表明，肠道菌群在基因表达中扮演着重要角色，它们也会参与于基因的表达。

近年有研究证实，肠道菌群的丰度变化与帕金森病相关［35-36］，无菌鼠在这方面也有应用。帕金森病是一种常见于老年的神经系统疾病，影响了中国250 万人口［37］。α-突触核蛋白的聚集被认为是一个称为突触核蛋白病的疾病家族的致病因素，包括帕金森病、多系统萎缩和路易体病［38-40］。人类中未调节的α-突触核蛋白表达与帕金森病的高风险相关［41］。α-突触核蛋白过表达（α-synuclein-overex⁃pressing，ASO）小鼠显示出精细、总体运动功能进行性缺陷和肠动力缺陷［42］。Sampson 等［43］通过横梁横移、极点下降、鼻腔黏着去除和后肢扣住反射4 个方式对ASO 小鼠、无特定病原菌野生同型小鼠、无菌同型小鼠以及无菌ASO 小鼠进行运动功能测试，发现与无特定病原菌野生同型小鼠相比，ASO 小鼠的测试结果显示需要更长的时间来完成衡量移动和极点下降，且其鼻腔黏着去除和后肢扣住反射存在障碍，无菌同型小鼠和无菌ASO 小鼠完成实验的能力相近。这说明肠道微生物参与了生物体蛋白的表达过程，能够影响α-突触核蛋白表达，进而影响帕金森病。

3.2 影响免疫功能 随着肠道菌群与癌症存在关联的观点出现，国内外涌现出了很多相关研究［44-45］。2018 年有960 万人死于癌症，全世界预计超过一半的癌症死亡发生在亚洲［46］。癌症免疫疗法作为继化疗、手术治疗和放疗后的“第四种疗法”，与传统的癌症疗法不同，免疫治疗激活或改造人体免疫系统抵抗肿瘤的固有功能，并使其成为攻击癌细胞的有力武器，而这一过程会被肠道菌群影响［47-48］。因此，也有不少基于无菌鼠研究癌症治疗方法的报道。

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibi⁃tors，ICIs）通过抑制肿瘤或基质细胞上T 细胞抑制受体与其同源配体的相互作用，释放T 淋巴细胞介导的免疫反应。Routy 等［49］选取了抗程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）及其配体PD-L1（7）单克隆抗体的ICIs，将8 名非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者的肠道菌群移植到无菌小鼠中，其中4 名患者对ICIs有应答，4 名无应答；2 周后对无菌小鼠接种MCA-205 肿瘤细胞，5 d 后用PD-1 单克隆抗体治疗无菌小鼠，移植了对ICIs 有反应的NSCLC 患者肠道菌群的无菌小鼠，其肿瘤生长延迟，显示出抗肿瘤效果，而在移植了对ICIs 无反应的NSCLC 患者肠道菌群的无菌小鼠，抗肿瘤效果不显著。Gopalakrishnan等［50］发现，肠道菌群中粪便细菌含量高的患者具有显著更长的无进展生存时间；分别将对抗PD-1 治疗无应答患者粪便微生物（NR-FMT）及有应答者粪便微生物（R-FMT）移植到无菌小鼠中，观察到R-FMT组无菌小鼠的肿瘤与NR-FMT 组相比显著减小，对抗PD-1 治疗的应答改善，肠道菌群中粪便大肠杆菌的丰度也显著升高；此外，NR-FMT 组无菌小鼠肿瘤中RORγT+T helper 17 细胞的比例增加，与抗PD-1 治疗无应答患者肿瘤的观察结果一致，同时该组脾脏中的调节性CD4+FoxP3+T 细胞和CD4+IL-17+T细胞的比例也较高，提示机体免疫反应受损。这些结果表明肠道菌群可以通过影响免疫功能改变机体抗肿瘤能力，并且抵抗能力可通过肠道菌群转移给无菌鼠。

3.3 影响激素调节 Collden 等［12］通过无菌小鼠研究了肠道菌群与睾酮（testosterone，T）和二氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）这2 种激素的关系。睾丸分泌的T 是男性体循环中最丰富的雄激素。在靶组织和肝脏中，T 可以通过一些不同的阶段性反应，如还原、葡萄糖醛酸化等，最终在男性生殖组织中生成DHT。他们采用气相色谱-串联质谱法检测了8 周龄常规饲养C57BL/6 无病原体小鼠和无菌小鼠肠道和血清中葡萄糖醛酸化T 和DHT 的含量，观察到无菌小鼠盲肠和结肠中葡萄糖醛酸化DHT 水平与无病原体小鼠相比显著升高，而游离DHT 水平显著降低，无菌小鼠盲肠和结肠中葡萄糖醛酸化T水平也比无病原体小鼠的相应部位高［12］。这些结果表明肠道菌群在激素调节中发挥着作用，参与了DHT 和T 的肠道代谢，对DHT 有去葡萄糖醛酸化的作用。

4 饮食对肠道菌群的影响

肠道菌群在维持机体健康方面承担着重要任务，其组成和活性也被肠道内底物的有效性和理化条件所影响。肠道菌群生长所需的大部分底物来自于饮食，包括未消化或未完全消化的碳水化合物，如抗性淀粉和膳食纤维，还有作为额外底物的粘蛋白、脱落的上皮细胞和消化酶由宿主提供［51］。

有许多研究已经进一步证实饮食对肠道菌群的影响。Desai 等［52］将包含14 种完全测序人造细菌的肠道菌群移植到无菌小鼠中，将无菌小鼠分别以富含膳食纤维（fiber-rich，FR）、缺乏膳食纤维（fiberfree，FF）和益生元（prebiotic，Pre）3 种膳食喂养。无菌小鼠粪便微生物群落动态研究表明，FF 饮食组几个物种的丰度发生了迅速而重复的变化，其中4 种粪便微生物——A. muciniphila、B. caccae、B.ovatus和E. rectale的 变 化 显 著。A. muciniphila和B. caccae均能在体外降解黏蛋白O-聚糖，B. ovatus和E. rectale不能代谢黏蛋白O-聚糖，但可以一起降解膳食纤维中的大部分多糖，在没有纤维的情况下，A. muciniphila和B. caccae的丰度迅速增加，纤维降解物种相应减少。当交替使用FR 和FF 饮食时，上述4 种细菌的丰度每天都快速波动，表明了它们对膳食纤维变化的动态响应能力。而在交替使用Pre 组和FF 组饮食的情况下，粪便菌群丰富度的波动变化与仅使用FF 方案相似。在缺乏膳食纤维的情况下，肠道菌群降解黏膜多糖、产生低度炎症、结肠长度变短和免疫反应发生变化等问题会出现，促进机体病原体易感性，过薄的结肠粘液层导致与病原体接触时，共生菌群与病原体一同引起严重疾病。Sonnenburg 等［53］将人源化小鼠分别喂养低微生物群相关碳水化合物（microbiota-accessible carbohy⁃drates，MACs）和高MACs 饮食7 周，再恢 复到 高MACs 饮食6 周，对比2 组小鼠的肠道菌群，并将实验小鼠用于繁殖幼崽，在断奶后，低MACs 饮食的亲代小鼠被恢复到高MACs 饮食，观察低MACs 组的菌群是否会在高MACs 饮食下恢复。该实验结果表明，低MACs 饮食会导致人源化小鼠微生物群多样性丧失，引入高MACs 饮食不能恢复微生物群多样性，在几代后再引入高MACs 饮食也不能恢复菌群多样性。Turnbaugh 等［54］对10 只雄性C57BL/6J 无菌小鼠饲喂富含结构复杂植物多糖的低脂膳食（“CHO 膳食”），12 周龄时对它们移植常规饲养小鼠的盲肠微生物。4 周后，将动物分为2 组，5 只饲喂富含饱和脂肪、不饱和脂肪及通常用作人类食物添加剂的碳水化合物的西式膳食，另外5 只饲喂CHO 膳食，对群体脱氧核糖核酸的聚合酶链反应产生的全长16S rRNA 基因扩增子进行测序，以确定每只小鼠的盲肠微生物群体结构，再使用UniFrac 指标对社区进行比较。结果表明，5 个西方饮食相关的盲肠群落比5 个CHO 饮食的盲肠群落彼此之间更相似，西方饮食相关的盲肠群落中厚壁菌门的相对丰度明显较高，拟杆菌门的相对丰度明显较低。此外，长期摄入高纤维食物也具有增加肠道菌群中普氏杆菌和类杆菌比例，从而改善肠道菌群糖代谢的作用［55-56］。

这些研究表明了饮食对于肠道菌群的重要影响。随着饮食的变化，肠道菌群的组成会自发地进行调整以适应新的环境，同时，在特定的饮食下，肠道菌群发生的变化是不可逆的。

5 总结

肠道菌群与机体健康关系密切，不同生理状态、疾病和饮食可影响肠道菌群的构成，肠道菌群也影响疾病的进展。近15 年来，大量研究证实肠道微生态系统失衡与多种疾病的发生关系密切，特别是肥胖、2型糖尿病等慢性代谢性疾病方向的研究发展迅猛［57］，无菌鼠逐渐成为肠道菌群研究的有利工具。当前无菌鼠相关研究仍有一些值得改进的地方。例如关于人类肠道菌群组成的大多数知识都来源于对粪便样品的分析，但是基于这些分析的微生物数据不能准确代表各种肠道部分的情况［58］，若能攻克相关问题，相信会取得更大的进展。无菌鼠作为肠道菌群研究的利器，相关技术也在近几年飞速发展。在国内，第三军医大学已经突破了无菌剖腹产、乳鼠人工哺乳及污染监测室等无菌小鼠培育的关键技术，建立了我国最具影响力的无菌动物平台［59］，目前拥有C57BL/6J、BALB/c、DBA 及Kunming小鼠等无菌小鼠系列品系［59］，为国内进行相关研究提供了坚实的基础。

总体而言，肠道菌群的研究为许多疾病的研究及治疗提供了新的思路和方法，可以预见将来会有越来越多基于无菌鼠的研究，这无疑将拓展我们对肠道菌群及相关疾病的认识，为治病救人提供更多的研究依据。