Cyclophilin A在病毒感染中的作用研究进展①

岳岩磊 张稳稳 张梦豪 刘 薇（河南农业大学生命科学学院，郑州 450002）

Cyclophilin A（CypA）为Cyclophilin家族成员，具有顺反异构酶活性，是一个高度保守并广泛存在的蛋白质。在人体内已发现有16个Cyclophilin家族成员，包括CypA、CypB、CypC、CypD、Cyp33、Cyp40，其中CypA和Cyp40主要定位于细胞质，CypB和CypC主要定位于内质网，CypD可直接与线粒体膜蛋白结合定位于线粒体，Cyp33的氨基酸末端含有RNA结合结构域，从而定位于细胞核［1］。

CypA是Cyclophilin家族中含量最多、细胞内分布最广的蛋白，约占细胞内总蛋白质的0.4%。人CypA基因定位于染色体7p13，DNA片段全长2 276 bp，包含5个外显子。CypA是一条含有165个氨基酸的多肽链，相对分子质量约为18 kD，其二级结构含有8条反向平行的β折叠，另一面由两条α螺旋形成桶状结构［1］。CypA是第一个从小牛胸腺分离出的免疫抑制剂环孢素A（Cyclosporin，CsA）的宿主细胞受体，因此被认为是一种重要的免疫因子［2］。CypA和CsA的复合物能够抑制钙调神经磷酸酶的活性，进而抑制T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）的去磷酸化，使其不能从细胞质向细胞核转移，从而影响下游基因活化，起到免疫抑制作用［3］。

作为Cyclophilin家族的重要成员，CypA也具有顺反异构酶活性，其机制是催化中心的电子层和脯氨酸残基的羰基基团改变了催化中心的偶极，这种变化导致两个氨基酸残基间肽键的旋转，从而使底物发生顺式和反式的变化［4］。最近发现CypA的顺反异构酶活性还具有其他功能，包括调控信号转导、分子伴侣、RNA加工、细胞凋亡、免疫应答等过程［5-6］。随着对CypA研究的深入，发现CypA还参与许多病毒的复制，且具有促进病毒复制的作用，如HIV-1、HBV等［7］。然而，CypA在流感等病毒的复制过程中却具有抑制作用［8］。

1 CypA在人类免疫缺陷病毒（human immu-nodeficiency virus，HIV）感染中的作用

HIV是反转录病毒，该病毒感染人类后可破坏人体免疫系统，导致人类获得性免疫缺乏综合症（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）的发病。人CypA可与HIV-1病毒结合并掺入病毒颗粒，参与HIV-1的病毒复制、脱壳等过程［9］。最初发现这一过程与HIV-1的多聚蛋白Gag结合相关，其通过与Gag前体（Pr55gag）的CA功能域相互作用影响病毒粒子的组装，尤其是第89位甘氨酸和第90位脯氨酸，而第25位丙氨酸、第27位赖氨酸、第29位脯氨酸和第30位赖氨酸位点突变后并未影响CypA与CA的互作［10-11］。抑制CypA和CA的结合时，HIV-1病毒的逆转录及cDNA的入核也受到抑制［12］。随后，GOLDSTONE等［13］证实CypA可与哺乳动物体内逆转录酶病毒限制因子Fv1结合形成融合蛋白Fv1CypA，而Fv1CypA能够阻止CypA与CA的结合，从而降低HIV-1的感染力。CsA处理后，CA突变体N57A的传染性明显减弱，表明其传染性依赖于CypA［14］。随着研究的深入，发现核HIV-1 DNA的积累依赖于CypA，且CypA在非洲绿猴肾细胞Vero中抑制HIV-1的感染是通过逆转录病毒限制因子Trim5α结合到衣壳，然后阻断HIV-1预整合复合物的核输入过程［15］。

研究发现，HIV-1转录蛋白的反式激活因子Tat（trans-activator of transcription，Tat）入核能够保证病毒基因的有效转录，大部分Tat由定位在质膜的磷脂酰肌醇4，5二磷酸PI（4，5）-P2招募而分泌到胞外，而Tat的棕榈酰化能够阻止Tat分泌。CHOPARD等［16］证实CypA促进HIV-1的Tat棕榈酰化并在未感染HIV-1的细胞中大量积累，然而，由于病毒的出芽过程中Gag与CypA的结合消耗了Cy‑pA，因此该过程特异性抑制Tat-棕榈酰化。与HIV-1相似，HIV-2原代分离株衣壳介导的感染同样需要CypA，且该过程也依赖于HIV-2与CypA的相互作用［17］。尽管CypA参与HIV复制过程的作用机制尚无定论，但CypA对HIV的复制是不可或缺的，由于CypA在HIV-1复制早期即发挥重要作用，因此其可能成为阻止HIV-1复制的药物靶点。

2 CypA在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染中的作用

HCV属于黄病毒科，是一种RNA病毒。与HIV-1相同，CypA在HCV病毒复制中发挥重要作用，CypA敲除细胞或用CsA处理的小鼠均可显著抑 制HCV病 毒 复 制［18-19］。CsA处 理 细 胞 后 发 现HCV的复制受到抑制，证实CypA能够抑制HCV RNA的 合成［20］。FOSTER等［21］证实CypA通 过与HCV的非结构蛋白5A（non-structural protein 5A，NS5A）的第二、第三个结构域结合催化NS5A，使NS5A更容易和HCV的正链RNA结合。此外，KAUL等［22］发现HCV-NS5A第二结构域上的两个突变（D2229G、L2266F）和第三结构域上一个突变（V2440A）的复制都失去了对CypA的依赖性，并增加了对非免疫抑制的CsA类似物Alisporivir（ALV）的抵抗力。第二结构域中另外两个突变（D320E、R318W）可能引起局部或整体折叠扰动，从而影响构象的变换，但并未影响CypA与第二结构域的相互作用［23］。另有报道证实，NS5A第二个结构域第314位的脯氨酸-色氨酸转变对HCV复制及与CypA相互作用至关重要，这项工作为进一步探究HCVNS5A第二结构域内无序蛋白质提供了分子基础［24］。CypA其他抑制剂SMCypI（small-molecule cy‑clophilin inhibitor，SMCypI）、ALV和SCY-635通过与CypA竞争结合，抑制CypA的肽脯氨酰顺反异构酶活性，进而破坏CypA与NS5A的相互作用，从而影响HCV的复制［25-26］。NAG等［27］证实CsA能够影响HCV的极低密度脂蛋白（very low-density lipopro‑tein，VLDL）合成途径，导致脂质滴增大、载脂蛋白B在脂质滴上的积累，抑制感染病毒的装配，提示CypA在脂质转运和HCV发病机制中具有重要作用。

HOPKINS等［25］证实CypA还能与非结构蛋白5B（non-structural protein 5B，NS5B）相互作用。NS5B被CypA招募至病毒复制复合体，该过程可能有利于NS5B在病毒复制过程中构象的正确转变，且依赖于CypA的顺反异构酶活性。通过分解位点的点突变实验表明，HCV的复制与CypA对NS5A-NS5B蛋白分解存在相关性，表明病毒多聚蛋白的裂解在一定程度上依赖于CypA［28］。在HCV感染过程中，CypA还参与调控干扰素（interferon，IFN）产生的信号通路，BOBARDT等［29］发现，CypA可通过其顺反异构酶口袋与干扰素调节因子9（interferon regulatory factor 9，IRF9）的碳末端区域结合，诱导IFN产生；而NS5A可竞争性地与CypA结合，破坏CypA和IRF9复合物的形成。CypA抑制剂SCY-635能够抑制双链RNA依赖的蛋白质激酶PKR（protein kinase R，PKR）和真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）的磷酸化，促使干扰素诱导基因的表达受到抑制，由此，CypA在该通路可能成为开发治疗丙肝病毒感染的新靶标［30］。在小鼠、树鼩和七种非人类灵长类动物中研究CypA对HCV复制时发现，只有在鼠的稳定表达CypA细胞中拯救出HCV，提示CypA参与HCV复制存在种属特异性［31］。随着越来越多新的抗HCV药物出现，包括直接抗病毒药物DAA（direct-acting antiviral agents）和具有非病毒靶点的药物（CypA抑制剂、IFN-λ、疫苗治疗），HCV治疗领域发生了巨大变化。鉴于这些药物具有更高的安全性和抗病毒效力，其用于治疗HCV的感染正在形成趋势［32］。

3 CypA在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染中的作用

HBV是一种DNA病毒，目前发现只有人和猩猩对HBV有易感性，能够引发乙型病毒性肝炎疾病。免疫共沉淀实验结果证实了CypA与HBV的小乙型肝炎病毒表面抗原SHBs（small hepatitis B virus sur‑face，SHBs）间的互作情况，而人肝癌细胞系中SHBs的表达能显著促进CypA分泌。给小鼠注射HBVSHBs后，随着小鼠炎症浸润程度的加剧，其血清中CypA水平也随之增加，而使用CsA处理的炎症应答反应与之相比较低［33］。动物实验结果表明，HBV表面抗原阳性转基因小鼠体内CypA蛋白水平有所下降，而过表达乙肝表面抗原HBsAg（hhepatitis B sur‑face antigen，HBsAg）细胞的培养基上清中，可以检测到高水平的CypA，提示HBsAg阳性细胞中的Cy‑pA可能分泌至细胞上清［33］。利用Hex 8.0.0软件进行分子对接，预测化合物HBF-0259与已知参与HBV组装的细胞因子和HBsAg分泌因子之间的相互作用发现，HBF-0259与CypA间存在相互作用，并且参与HBsAg分泌及HBV整合过程［34］。此外，研究表明非免疫抑制剂ALV通过抑制肝细胞系中CypA的表达，进而抑制HBV的DNA复制及HBsAg的产生和分泌［35］。NKONGOLO等［36］发现CsA通过与钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白直接结合，并与介导病毒进入的前S1蛋白（preS1）结构域重叠，从而抑制HBV的进入，且CsA通过CypA发挥免疫抑制作用。共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）分子的清除是未来治疗HBV的主要挑战，因此，宿主分子如TLR7（Toll-like receptors 7，TLR7）和CypA已成为预防HBV侵入和复制的潜在靶点［37］。

4 CypA在流感病毒（influenza virus，IV）感染中的作用

流行性感冒病毒简称流感病毒，是一种造成人类及其他动物患流行性感冒的病毒。有报道证实CypA可被包装到IV粒子中，早期研究发现，CypA既不影响病毒基因组的复制和转录，也不影响病毒mRNA的出核，但却在IV复制的蛋白水平上有明显抑制效果。例如，人的CypA可与IV的基质蛋白1（matrix protein 1，M1）中间结构域结合，通过影响新合成的M1蛋白入核，从而影响IV的早期复制。CsA在CypA缺失的情况下可抑制病毒mRNA的出核，而在CypA存在的情况下又可促进CypA和M1蛋白的结合进而影响病毒的复制［38］。CypA能够通过泛素/蛋白酶体途径促进M1蛋白的降解从而抑制IV的复制［39］。MAHESUTIHAN等［40］证实CypA可通过E3泛素连接酶AIP4（atrophin-1 interacting protein 4）介导M1的K102和K104位点泛素化调控M1蛋白稳定性。有趣的是，CypA对AIP4介导的M1以上两个位点的泛素化还能抑制M1的出核过程，该结果进一步解释了CypA对M1的出核调控及复制机制。XU等［41］发现鸡的CypA同样具有抑制IV复制的作用。此外，LIU等［42］证实CypA还能通过调控RIG-Ⅰ（reti‑noic acid inducible gene-Ⅰ）介导的Ⅰ型IFN的产生抑制IV的复制。

5 CypA在其他病毒感染中的作用

在感染轮状病毒（rotavirus，RV）的细胞中发现CypA与其非结构蛋白5（nonstructural protein 5，NSP5）存在共定位，说明CypA可能被招募到RV病毒粒子中，并且发现CypA能通过其顺反异构酶活性抑制RV的复制［43］。HE等［44］证明CypA除了能够与RV的结构蛋白VP2（viral protein 2）相互作用外，还能通过促进Ⅰ型IFN的产生抑制RV复制，此过程不依赖CypA的PPIase活性，而是依赖于CypA对JNK（c-Jun N-terminal kinase）信号通路的激活。黄热病毒（yellow fever virus，YFV）的复制同样高度依赖宿主因子，YFV的非结构蛋白4B（non-structural protein 4B，NS4B）参与病毒的复制和免疫逃逸，通过GST pull-down和LC-MS/MS实验证实CypA与NS4B间存在相互作用，进而调控YFV的复制［45］。人类冠状病毒（human corona virus，HCoV）-NL63和HCoV-229E的复制也受CypA敲低或敲除的影响［46-47］。另外，CypA抑制剂CsA处理后能够抑制多种CoV的复制［48］。WILDE等［48］通过对CsA等CypA抑制剂的研究发现，CypA是巢式病毒复制的宿主因子，多种冠状病毒和动脉病毒的复制受极低浓度的CsA、ALV及NIM-811的抑制［47，49-50］。目前，ALV是临床上最先进的广谱抗病毒药物，其通过靶向宿主蛋白CypA发挥作用。在组织培养中观察到ALV对makona埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）表现出轻微的抗病毒作用，与许多其他对人类有致病性的病毒相比，EB‑OV的复制不依赖于CypA［51］。研究发现，感染人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）后，CypA表达上调并向细胞外分泌，作为CypA胞外受体，CD147（cluster of differentiation 147，CD147）通过Cy‑pA-CD147-ERK（extracellular regulated protein kinas‑es）调控核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的激活及IFN-β的产生，从而介导抗病毒反应［52］。随后，ABDULLAH等［53］发现CsA在HCMV发病机制中具有双重作用，一方面，CsA可通过抑制T细胞功能参与病毒复制，另一方面，其还参与由反式激活因子IE2（immediate early 2）介导的抗巨细胞病毒作用，以上两个过程中均有CypA参与。采用瞬时转染过表达CypA的方法研究CypA对新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）复制增殖的影响时发现，CypA过表达可抑制NDV的复制和增殖，且NDV感染后CypA表达上调，说明在NDV感染过程中Cy‑pA起负调节作用［54］。通过检测110位因EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）感染而患鼻咽癌的患者血清发现，CypA的mRNA和蛋白水平显著高于正常人，提示CypA与鼻咽癌标志物EBV-VCA-IgA联合分析将提高鼻咽癌的诊断准确度［55］。

6 总结与展望

体外研究表明许多DNA或RNA病毒感染宿主细胞后可诱导CypA表达，一方面，CypA可能通过蛋白质的折叠、信号转导、炎症等过程参与免疫应答，维持细胞稳态；另一方面，CypA在部分病毒的复制过程中与病毒蛋白互作，参与病毒入核及病毒复制等多个过程。

虽已证实CypA在病毒感染中发挥重要作用，但仍有许多问题有待深入研究，如在病毒感染后，介导CypA变化的关键病毒蛋白有哪些；细胞感染病毒后CypA的表达变化及机制还有待进一步探索；在天然免疫中，不同病毒感染后CypA既参与对I型干扰素的调控，又参与病毒复制过程，而CypA在两者间的动态平衡过程中发挥何种作用尚不明确；以及CypA是否可通过干预病毒复制而成为一种新的抗病毒靶点药物也有待深入研究。