间充质干细胞来源的外泌体对肺损伤的治疗作用及其潜在机制*

宋晓婉， 梁 璐

［1汉氏联合（天津）干细胞研究院有限公司，天津301700；2天津百恩生物科技有限公司，天津300318］

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是再生医学领域中应用最广泛的干细胞［1］。MSC 具有抗炎、免疫调节、损伤修复、促血管新生及抗纤维化等生物学特性。目前MSC在肺损伤疾病中的治疗研究越来越多，实验数据表明MSC 能够明显降低肺部炎症反应，减少肺组织损伤［2］。越来越多的研究表明MSC 发挥治疗作用的主要机制是旁分泌作用，间充质干细胞来源的外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-EXOs）作为其主要的旁分泌组分，是其发挥生物学功效的关键。本文就MSC-EXOs的生物学特性及其对急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和其他肺损伤疾病的治疗作用和潜在机制做一综述。

1 MSC-EXOs的生物学特性

外泌体是一种胞外脂质双层膜囊泡，直径为40～100 nm，密度为 1.10～1.18 g/mL，表达特异膜蛋白CD9、CD63 和 CD81［3］，电镜下观察呈典型杯状形态。外泌体广泛存在于各种体液中，如血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁和汗液中，是介导旁分泌效应的重要信使［4］。外泌体主要通过3种方式作用于靶细胞，从而实现胞间通讯进而发挥生物学效应：（1）直接与靶细胞膜融合，将内容物蛋白质、mRNA、miRNA 和siRNA释放到细胞质中；（2）通过胞吞作用被靶细胞摄取；（3）外泌体辨别并结合靶细胞表面上的特异性受体。此外，不同细胞来源的外泌体参与不同的生理病理过程，如处理废弃蛋白质、呈递抗原、交换遗传信息、免疫应答、组织修复再生以及代谢，参与血管生成、炎症、肿瘤转移等。这些功能的发挥取决于外泌体中的活性组分，尤其是RNA 和蛋白质。现有手段很难获得纯的外泌体成分，多是以外泌体为主的胞外微囊泡。胞外囊泡根据尺寸大小可分为凋亡小体、微泡和外泌体。除凋亡小体直径大于1 μm 外，微泡和外泌体都属于纳米级别，但两者产生的途径不同。微泡是由质膜脱落产生的，而外泌体的产生则是通过胞内体途径，即早期内体膜凹陷形成具有许多腔内囊泡的多泡体，多泡体与质膜融合释放出外泌体，因此外泌体也是从内体分泌的唯一一类细胞外囊泡［5］。

目前，MSC-EXOs 已成研究热点，MSC-EXOs 携带丰富的亲本细胞来源的蛋白质、RNA 等生物活性物质，发挥类似于MSC 的生物学功能，其运输、保存的条件与蛋白质类似，相比MSC 更具成药优势。研究表明MSC-EXOs 具有免疫调节、抗炎、抗纤维化、抑制氧化应激、增强血管生成等作用。MSC-EXOs富含糖酵解相关酶，可增加ATP 的产生，减少组织细胞死亡［6］；MSC-EXOs 含有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、转化生长因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10 和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）等细胞因子，有利于血管生成和免疫调节［7］；此外，外泌体中的miRNA 可调控基因表达，参与多种生理病理过程，如外泌体释放的miR-125b-5p能够促进心肌梗死区的功能恢复［8］。

2 MSC-EXOs对ALI的治疗作用及其潜在机制

ALI 是指肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭肺损伤。根据发病原因分为：（1）直接肺损伤因素：严重肺部感染，胃内容物吸入，肺挫伤，吸入有毒气体，淹溺、氧中毒等；（2）间接肺损伤因素：严重感染，严重的非胸部创伤，急性重症胰腺炎，大量输血，体外循环，弥漫性血管内凝血等［9］。ALI 发展至严重阶段（氧合指数＜200）被称为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ARDS 致死率高且无特效药，幸存活下来也多伴有后遗症，影响长期生活质量。大量临床前研究表明MSC-EXO对ALI引起的肺泡上皮及内皮细胞损伤、肺泡液清除率下降、肺纤维化等具有治疗作用。以下就MSC-EXOs 对ALI 的可能作用机制进行了归纳和总结。

2.1 免疫调节/抗炎特性 炎症失调是ALI/ARDS的一个关键病理学特征。MSC 对固有免疫反应和适应性免疫反应均具有免疫调节作用，在ALI 动物模型的治疗中发挥抗炎作用［10-12］。

在不同的ALI 动物模型中，MSC-EXOs 均能降低炎症因子表达水平并改善肺功能［13-16］。MSC-EXOs能抑制B 细胞增殖分化，并呈剂量依赖关系［17］。MSC-EXOs 能诱导 Th 细胞向 Th2 细胞而不是 Th1 细胞转化，能抑制T细胞向Th17细胞分化，增加调节性T 细胞水平［18］。Del Fattore 等［19］和 Frvaro 等［20］证明，MSC-EXOs 能增加调节性T 细胞和效应性T 细胞比例，抑制T 细胞释放促炎细胞因子如干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及 IL-1β，促进抗炎细胞因子如 TGF-β、IL-10及前列腺素E（2prostaglandin E2，PGE2）表达。多项研究结果表明，MSC-EXOs 能将促炎M1 型巨噬细胞极化为抗炎M2 型巨噬细胞。Ti 等［21］的研究表明，经脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）预处理的MSC 释放的外泌体能促进巨噬细胞向M2型极化，进一步研究结果显示此效应机制是由外泌体转运microRNA let-7b 激活 TLR4/NF-κB/STAT3/AKT 调节的信号通路所介导的。在LPS诱导的ALI小鼠模型中，MSC 可通过外泌体介导线粒体转移，促进巨噬细胞向抗炎表型转化，从而有效缓解肺损伤［22］。在小鼠缺血再灌注肺损伤模型中，MSC-EXOs 能显著降低M1 型巨噬细胞相关因子 IL-8、IL-1β、IL-6 和 TNF-α的表达，增加M2 型巨噬细胞免疫抑制细胞因子IL-10 和 TGF-β 的表达［23］。近来 Huang 等［24］研究表明，与年轻MSC-EXOs相比，衰老MSC-EXOs不能成功诱导炎症肺组织中M2型巨噬细胞的产生，提示外泌体的功能与其亲本细胞的功能状态直接相关。

2.2 对肺泡上皮和内皮细胞的保护作用 MSCEXOs能抑制肺泡上皮的凋亡，起到保护作用。MSCEXOs 能够增加内毒素损伤性的Ⅱ型肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，AECs）内ATP 的水平，提高AECs 存活率［25］。Yi 等［26］将 LPS 处理的Ⅱ型 AECs 与过表达miR-30b-3p 的MSC-EXOs 共培养，结果显示MSC-EXOs 有效抑制AECs 凋亡，促进其增殖。除了保护效应外，MSC-EXOs可能通过调节炎症肺组织中蛋白酶/抗蛋白酶平衡来保护肺上皮细胞。Harrell等［27］的研究表明，α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）聚集吸附于 MSC-EXOs 表面（AAT 的天然载体），促进外泌体的稳定及体内活性。AAT 是中性粒细胞源蛋白水解酶的一个潜在抑制剂，能保护肺上皮细胞并发挥抗炎免疫调节效应。经IL-1β 预处理的MSC-EXOs，其AAT 基因表达更高，且与非IL-1β预处理的MSC-EXOs 相比具有更高的抗弹性蛋白酶活性。

MSC-EXOs 对肺血管内皮也具有保护作用。Li等［23］证明，MSC-EXOs对氧化应激诱导的肺内皮细胞凋亡具有保护作用，该作用依赖于外泌体中miR-21-5p 的抗凋亡特性。气管内给予MSC-EXOs 能抑制肺内皮细胞内源和外源凋亡途径，用miR-21-5p拮抗剂对MSC 进行预处理则完全消除了MSC-EXOs 介导的caspase-3、-8 和-9 抑制效应，降低了保护作用。人第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）和程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）是 miR-21-5p的主要靶点，经miR-21-5p 拮抗剂处理的MSC-EXOs治疗缺血再灌注损伤小鼠时，其PTEN 和PDCD4 的表达没有减少，肺内皮细胞持续凋亡，表明miR-21-5p 抑制PTEN 和PDCD4 表达进而保护肺内皮细胞是外泌体治疗缺血再灌注肺损伤小鼠的作用机制。

2.3 改善肺泡液清除率 体内外研究证明注射MSC 能恢复LPS 诱导的ALI 及严重性细菌性肺炎导致的肺泡液清除率下降，部分机制是MSC 通过分泌角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）和血管生成素 1（angiopoietin-1，Ang-1），恢复Ⅱ型AECs 中关键的钠离子通道ENaCα，并防止肺上皮肌动蛋白应力纤维形成［28-29］。Li 等［30］也证明 MSC 通过分泌 KGF 上调 Na+-K+-ATP 酶 α1 亚基的表达，进而恢复Ⅱ型肺泡上皮细胞肺泡液的转运功能。

MSC-EXOs 改善肺泡液清除率的机制与MSC 相似。MSC-EXOs 通过将KGF mRNA 转运至靶细胞，恢复其肺泡液清除率，进而对大肠杆菌感染性肺炎小鼠模型和大肠杆菌感染性损伤的人肺组织的肺泡上皮细胞起到了保护作用［25，31］。MSC-EXOs 通过将Ang-1 mRNA 转运至靶细胞，阻止肌动蛋白应力纤维的形成，进而恢复损伤的人肺微血管内皮细胞的蛋白通透性［32］。

2.4 抗菌活性 研究表明MSC能分泌抗菌因子，如脂蛋白2 或IL-37，直接参与抗菌；或者通过调节单核/巨噬细胞来增加对细菌的吞噬作用，进而间接参与抗菌。此外，MSC 还可以抑制中性粒细胞的凋亡，延长白细胞存活，增加抗菌活性，减少免疫细胞向受损肺泡转运［33-34］。

MSC-EXOs 可以通过转运线粒体至损伤肺泡单核/巨噬细胞，增加其氧化磷酸化，从而诱导巨噬细胞吞噬作用增强［22］。MSC-EXOs 还可通过促进白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）的合成增加肺部浸润的中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬作用和抗菌活性［35］。MSC-EXOs 中的miR-145 能降低肺泡巨噬细胞中多药抗性相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）的表达，进而导致肺泡巨噬细胞LTB4释放增加，提高了抗菌活性和细菌清除率，减轻了小鼠细菌性肺炎的严重程度［35］。有趣的是，用TLR3 激动剂或 IFN-γ 预处理 MSC 能增强 MSC-EXOs的抗菌效应［25，36］。

MSC-EXOs 也有助于病毒清除。Qian 等［37］的研究表明，脐带来源的MSC-EXOs 能将miRNA（包括let-7f、miR-145、miR-199a 及 miR-221）转运至宿主细胞，进而抑制丙型肝炎病毒（hepatitis virus C，HCV）复制，且与干扰素α 或者特拉普韦联合用药时能增强其抗HCV能力。

2.5 对肺纤维化的抑制作用 肺纤维化是肺部严重纤维增生失调，其特征是成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏［38］。在特发性肺纤维化小鼠模型中，MSC-EXOs可减少胶原沉积和炎症反应，进而改善肺纤维化［39］。单纯静脉注射人骨髓来源MSC-EXOs 显著地缓解了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，MSC-EXOs 治疗后，肺组织中Ashcroft 评分得到改善，胶原沉积减少；其主要作用机制是通过调节巨噬细胞表型和功能来实现的［40］。MSC-EXOs 显著减少了表达 TGF-β1、精氨酸酶1（arginase-1，ARG-1）和 CD206 的肺泡巨噬细胞的数目，提示巨噬细胞可能是外泌体的主要细胞靶标。给予成纤维细胞来源的外泌体治疗时无抗纤维化疗效，表明外泌体的疗效与其亲本细胞性质有关。

用MSC来预防二氧化硅诱导肺炎小鼠的肺部炎症和纤维化时，Phinney 等［41］研究表明 MSC-EXOs 含有大量的miR-451（一种TNF及巨噬细胞迁移抑制因子），miR-451 可以调节巨噬细胞Toll 样受体信号及相关细胞因子分泌。MSC-EXOs 可能通过转运miR-451增加其在巨噬细胞中的表达来抑制TNF的分泌，以此应答二氧化硅的刺激。

3 MSC-EXOs对其他肺损伤疾病的治疗作用

动脉型肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种进行性疾病，其特征是肺动脉重塑、肺浸润增加、血管腔横截面积减少及肺血管阻力增加。前期诱因导致的免疫失调、促炎性巨噬细胞活化和炎症介质升高对于PAH 的后期发展至关重要。研究表明，MSC-EXOs能够介导促炎性与抗炎性巨噬细胞之间的平衡，维持了免疫稳态，缓解了PAH的恶性发展［42］。除了免疫调节作用，MSC-EXOs对线粒体功能也具有保护作用，进而能够缓解PAH。MSC-EXOs 通过抑制人组蛋白脱乙酰酶sirtuin-4 的表达，增加了肺动脉平滑肌细胞中丙酮酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的表达，恢复肺动脉平滑肌细胞的能量平衡，提高耗氧量，从而改善了疾病相关的线粒体功能［43］。

在高氧诱导的支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）大鼠模型实验研究中，通过气管内给予MSC 或MSC-EXOs 来对比两者效果，结果表明两者对BPD 都有缓解作用，且MSC-EXOs 改善肺泡化及肺血管化参数的效果更好，表明MSCEXOs 是一种有效的治疗 BPD 的方法［44］。在新生儿高氧性BPD 模型中，MSC-EXOs 治疗改善了肺泡化、纤维化和肺血管重塑的情况，进而增强了肺功能。MSC-EXOs能显著激活骨髓来源的巨噬细胞，降低了TNF-α、IL-6等巨噬细胞M1表型标志物的表达水平，提高了Arg1、CD206 等M2 表型标志物的表达。这表明MSC-EXOs 通过调节巨噬细胞免疫表型，抑制促炎性 M1 表型，增强抗炎 M2 表型从而改善 BPD［45］。在另一项高氧诱导的BPD 小鼠模型研究中，腹腔注射MSC-EXOs 可以减轻肺部炎症，改善肺泡-毛细血管渗透性，抑制肺组织形态学改变。研究者认为MSC-EXOs 中的肿瘤坏死因子刺激基因6（tumor necrosis factor-stimulated gene-6，TSG-6）对BPD 治疗至关重要。TSG-6沉默的MSC 分泌的MSC-EXOs 不具有治疗BPD的效果，证明MSC-EXOs中的TSG-6是治疗BPD的关键蛋白［46］。

MSC-EXOs 对过敏性气道炎症具有修复作用。在曲霉菌丝提取物诱导的ALI 模型中，MSC-EXOs 减缓了气道高反应性，肺部炎症，抑制了支气管肺泡灌洗液中可溶性Th2/Th17 相关细胞因子表达，这表明MSC-EXOs 通过将Th2/Th17 炎症反应转化为反调节性Th1 反应，减轻炎症，缓解了Th2/Th17 介导的气道高反应性［47］。

4 结论与展望

综上所述，大量临床前研究已证明MSC-EXOs对各种肺损伤病理进程均具有一定治疗缓解作用，其作用机制主要是通过将生物活性成分，如蛋白因子、miRNA、mRNA 等转运至靶细胞中发挥其类似于亲本细胞的免疫调节，损伤修复等治疗作用。这为MSC-EXOs 作为一种无细胞疗法治疗肺损伤提供了理论依据。目前动物实验中应用的MSC-EXOs 的组织来源基本都是小鼠或者大鼠的骨髓［13，41］；人源的MSC-EXOs 的组织来源主要是骨髓［25，31-32，47］，也有研究者使用的是脐带［16］或脂肪［24］来源的。而 MSCEXOs 的培养方法没有统一标准，或使用无血清培养基［15，26，47］，或使用化学限定培养基［6］，或使用去外泌体血清培养基［24］；培养时长也各异，过夜、24 h、48 h或72 h 的报道均有。MSC-EXOs 对保存条件要求不高，重悬于PBS 中置于-80 ℃保存是常见的保存方式［15，24，26］。

MSC-EXOs 与 MSC 相比更具治疗优势：（1）降低了干细胞治疗的致瘤风险；（2）可在无二甲亚砜的情况下冻存于-80 ℃而不失活；（3）体积小，易于在血液系统中循环，不易造成微血管阻塞。虽然MSC-EXOs在治疗应用方面很有潜力，但是大都还只停留在临床前阶段，还需要更多的临床数据来验证其疗效。截至到2020 年8 月3 日在clinicaltrial 网站上注册的关于MSC-EXOs的临床试验有9例，用于治疗急性缺血性中风、难治性黄斑裂孔、移植物抗宿主病干眼症及阿兹海默症等。在MSC-EXOs 向临床转化的过程中仍有许多难题亟需解决：（1）亟需建立外泌体质量体系标准：不同来源，不同培养条件，不同预处理以及细胞老化等问题都会影响到外泌体的质量和效力；（2）亟需规模化制备工艺和纯化技术：如何通过大规模生产获得足量的原液，和规模化的分离提纯方法获得高纯度的MSC-EXOs 来满足临床需求，是目前MSC-EXOs 生产制备中亟需解决的问题；（3）亟需最适的临床应用方式：目前动物实验中的给药方式主要是局部气管内给药［44］和静脉给药［47］，两种治疗方式均有效［25］。治疗的效果和MSC-EXOs 的给药浓度呈正相关，但如何确定最佳给药剂量、浓度及给药途径还需要更深入的研究。随着研究的深入和全面，MSC-EXOs作为一种基于干细胞的无细胞治疗方法未来将有可能成为替代干细胞治疗的有效手段，将获得更长足的发展。