非洲猪瘟病毒结构蛋白CD2v的功能研究进展①

王 曼 沈宇清

（东南大学医学院，南京210000）

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）类属非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是一种有包膜的、核衣壳呈二十面体对称形态的病毒。ASFV基因组由线性的双链DNA 组成，大小为170～193 kbp。其中包含150～167个开放阅读框（open reading frame，ORF），编码150～200 种蛋白质。ALEJO 等［1］利用蛋白质组学分析鉴定出68种病毒蛋白，仅占基因组编码能力的39%。这些蛋白在病毒组装、基因转录和RNA 修饰、维护基因组完整性、入侵宿主和免疫逃逸等方面发挥着重要作用。

ASFV 的感染与传播途径为野猪-软蜱-家猪。首先是疣猪、丛林猪等因为某种不明确的途径被感染，软蜱叮咬被感染猪而携带病毒，继而叮咬家猪后将病毒传播给家猪。在传播过程中，疣猪等天然宿主的临床症状很轻，而家猪感染后会出现急性出血热，病死率很高。软蜱作为病毒的生物载体和贮藏库对病毒的传播起关键作用。

ASFV 的致病机制十分复杂，目前尚未完全解析。ASFV 的主要宿主细胞是单核细胞和巨噬细胞，也能感染树突状细胞。它通过宿主巨噬细胞中网格蛋白介导的内吞作用和巨噬细胞胞饮作用进入细胞。病毒进入内体中，在内体内发生脱壳，病毒核酸物质通过微管系统迁移到病毒工厂进行复制［2-3］。感染的巨噬细胞还可能通过分泌IL-1α、TNF-α 等细胞因子来诱导未感染的T、B 淋巴细胞大量凋亡，从而导致免疫系统功能受损［4-5］。

目前，ASFV 中的p72、p30、p54 等蛋白的研究进展已被许多综述提及，而本文主要关注的是ASFV的CD2v 蛋白［6-7］。CD2v 是由ASFV 的EP402R 基因编码的病毒外膜糖蛋白，也被称为pEP402R。它由402个氨基酸（amino acid，aa）构成，预测的蛋白质大小为46.5 kD［8］。因其aa 序列与T 淋巴细胞表面黏附受体CD2 具有很高的相似性，被认为是CD2 的同源物。CD2v在促进病毒复制与传播、病毒免疫逃逸等方面发挥着重要作用，也是ASFV 疫苗研究的热点靶标。

1 ASFV包膜蛋白CD2v的结构特征

CD2v 是一种病毒包膜蛋白，其结构被分为4 个结构域：①20 个aa 构成的N 端信号肽结构域［9］；②183 个aa 构成的胞外结构域，此结构域存在高度的糖基化现象［10］；③25 个aa 构成的疏水跨膜区域；④174 个aa 构成的胞内结构域。当ASFV 入侵宿主细胞后，CD2v 会在内质网或高尔基体中被切割，经切割后产生的63 kD 的N 端以糖基化形式存在，而26 kD的C端以非糖基化形式存在［10］。

测序结果显示，CD2v与CD2的胞外结构域具有很高的相似性，但胞内区域序列的相似性较低。CD2v C 端包含11 个重复的六肽序列PPPKPC，为CD2v 的特有序列。在C 端还存在一段富含脯氨酸的酸性结构域，其功能尚未被解析。

2 CD2v在ASFV致病机制中的作用

2.1 介导红细胞吸附，促进病毒的体内播散 大多数的ASFV 毒株都能诱导红细胞吸附，其特征是猪红细胞黏附在病毒感染细胞的表面，从而使得感染细胞能够随着红细胞传播。RODRÍGUE 等［9］发现CD2v 的破坏会抑制ASFV 感染细胞与猪红细胞的黏附能力，说明CD2v 在介导感染细胞与红细胞黏附中起主要作用，借此参与病毒的体内播散。

CD2v能够增加软蜱中病毒的复制。ASFV可以在软蜱体内复制，存活时间长达3～5年，并可通过软蜱叮咬传播给家猪等易感动物。ROWLANDS 等［11］发现天然低毒性ASFV 分离株NH/P68 基因组中CD2v 基因被破坏。他们通过在NH/P68 中过表达CD2v 基因，使其恢复了红细胞吸附表型，并发现重组病毒在软蜱中能够建立持续感染，证明了CD2v蛋白具有介导红细胞吸附并增加ASFV 在宿主中传播功能。

2.2 协助病毒定位病毒工厂，促进病毒的细胞内复制 CD2v的C端序列能够帮助ASFV定位在病毒工厂（viral factory，VF）区域附近从而促使病毒的复制。在病毒的复制周期中，病毒在离散的细胞质区域内进行蛋白翻译和结构组装，该区域被称为“病毒工厂”。其定位特点为在工厂的外围分布着磷酸化的翻译起始复合物eIF4F。ASFV 晚期mRNA 以及核糖体、线粒体等细胞器也位于这些区域［12］。VF位于靠近细胞核的细胞质中，由中间丝蛋白Vimentin所包绕［13］。GOATLEY 等［10］将V5 标签插在CD2v 基因的5'端，将HA 标签插在CD2v 基因的3'端，构建成质粒SV5CD2vHA。同时还构建了1 个删除了大部分胞内序列的突变质粒SV5CD2v-cytoHA。他们将2 种质粒分别转入细胞，然后用ASFV BA71V 病毒毒株进行感染，18 h后分别用抗V5抗体、抗HA抗体和抗VP72 抗体（针对ASFV 主要衣壳蛋白的抗体）对表达SV5CD2vHA 蛋白和SV5CD2v-cytoHA 蛋白的细胞进行染色。结果发现，SV5CD2vHA蛋白无论是用抗V5 抗体还是用抗HA 抗体检测，都与用抗VP72 抗体鉴定的病毒工厂共定位，而SV5CD2v-cytoHA 蛋白并没有出现与病毒工厂共定位现象。因此推测SV5CD2v-cytoHA 中缺失的胞质片段是CD2V蛋白定位在VF所必需的，即CD2v的C端序列能够帮助其定位在VF附近，从而促进病毒的复制。

2.3 影响病毒的体内复制，但不影响病毒的毒力8-DR 和EP402R 均为编码CD2v 的基因名称。BROCA 等［14］构建了ASFV 分离株Malawi Lil-20/1 的基因缺失突变体Δ8-DR 及其回复突变体8-DR.R。在体外，Δ8-DR、8-DR.R 和亲本病毒在猪巨噬细胞培养物中表现出难以区分的生长特征。为了更详细地比较它们致病力的差异，BROCA 等［15］将3 株病毒分别感染模型动物。在感染后2 d、4 d、6 d 和8 d处死动物并收集组织样本，测量其中病毒的滴度。他们发现感染了Δ8-DR 病毒的猪淋巴组织和骨髓中病毒滴度较野生猪和8-DR.R 低，这表明CD2v 在一定程度上影响了病毒的体内复制能力。但是他们也发现Δ8-DR、8-DR.R和亲本病毒在模型动物的疾病发作、病程和死亡率上都相似，因此CD2v 不影响病毒的毒力。与此一致的是，BROCA 等［15］发现从 ASFV 分离株Georgia2010 的基因组中删除8DR基因（ASFV-G-Δ8-DR）并不会显著改变病毒的毒力。他们证实感染ASFV-G-Δ8-DR 与亲本病毒的动物临床症状非常相似，只是在病毒滴度上显示出一些差异。除此之外，RAQUEL等［16］发现低毒性ASFV分离株NH/P68 除了包含8DR 的突变外，它还具有MGF360和505基因的缺失。已有研究表明MGF360和505 基因与ASFV 的毒力密切相关，这可能才是NH/P68 株毒力降低的主要原因［17］。综上所述，虽然CD2v 影响病毒的体内复制，但并不影响病毒的毒力。

2.4 参与病毒的免疫逃逸 CD2v 的C 端的重复序列PPPKPC与SH3P7蛋白的相互作用可能参与ASFV的免疫逃逸。KAY-JACKSON等［18］利用酵母双杂交系统，将SH3P7基因分别与CD2vi（编码221 aa～342 aa，包含C 端的重复序列）、CD2vii（编码221 aa～306 aa，不包含C端的重复序列）、CD2viii（编码297 aa～335 aa，仅包含C端的重复序列）基因共转化酵母，通过检测β-糖苷酶的表达来定位CD2v 与SH3P7 相互作用的区域。结果发现只有CD2vi 和CD2viii 出现了阳性的相互作用，说明CD2v通过C端的重复序列结构与SH3P7 相互作用。SH3P7 是一种多功能的衔接蛋白，它能够偶联细胞膜受体与肌动蛋白细胞骨架参与淋巴细胞的活化，能够通过GTPase依赖性方式定位在肌动蛋白组装的位点、细胞生长的区域和细胞运动的前沿，也能调节JNK1 的信号传导过程从而激活转录因子［19-20］。由于SH3P7 与肌动蛋白组装和高尔基体囊泡运输有关，因此CD2v 与SH3P7 的相互作用可能参与ASFV 感染的细胞中肌动蛋白丝的重排和高尔基体的功能，影响多种免疫分子包括细胞因子、黏附因子和主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）等的运输，从而影响免疫系统的识别［21］。

CD2v 与AP-1 的相互作用在免疫逃逸中发挥重要作用。AP-1 是一种衔接蛋白，参与了蛋白质从高尔基体到内体的转运［22］。它能募集网格蛋白形成囊泡并通过识别膜蛋白胞质尾部的分类信号在胞内的“ 货物”分类转运中起关键作用。 PÉREZNÚÑEZ 等［23］发现CD2v 的羧基末端能够与AP-1 结合，并且在ASFV 的感染过程中与AP-1 共定位在病毒工厂的周围。AP-1 已被证明能够与多种病毒蛋白包括HIV-Nef 和BPV-E6 结合。这种相互作用被认为能够破坏宿主细胞胞内一些物质运输，在病毒感染细胞的免疫逃逸方面发挥作用。如在HIV 的感染中，AP-1 与HIV-Nef 蛋白的结合能够将MHCⅠ隔离在细胞质中，降低胞膜表面MHCⅠ类分子的表达，从而使病毒感染细胞逃脱CTL 细胞的杀伤［24］。因此推测CD2v 和AP-1 的相互作用在ASFV 的免疫逃逸中具有重要作用，但目前尚缺乏相关实验证据。

3 CD2v在ASFV疫苗研究中的应用

3.1 基于CD2v 的ASFV 疫苗研究 迄今已有CD2v 应用于减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA 疫苗和病毒载体疫苗的研究报道。MONTEAGUDO 等［25］删除了强毒株BA71 的部分CD2v 基因（除了C 末端的其他序列），将其作为减毒活疫苗进行动物免疫。发现BA71ΔCD2v 能够以剂量依赖的方式保护猪免受ASFV 的攻击。 该疫苗不仅能够抵抗同源的BA71 病毒攻击，也能抵抗异源强毒株E75 的攻击。BA71ΔCD2v 在COS-1 细胞和猪肺泡巨噬细胞中生长良好而不影响其遗传稳定性、致病性和免疫原性，适合应用于大规模生产，具有良好的疫苗生产和应用前景。

RUIZ-GONZALVO 等［26］构建了一种能够表达CD2v 蛋白的重组杆状病毒。利用3 只猪接种重组CD2v 蛋白后再用野生ASFV 病毒毒株E75 攻击，最终3 只猪都获得了保护性免疫并且产生了针对CD2v的特异性抗体。这些结果验证了CD2v蛋白作为ASFV亚单位疫苗的可行性。

在核酸疫苗研究中，ARGILAGUET 等［27］构建了3 种质粒：pCMV-PQ（表达p54 和p30 蛋白）、pCMVsHAPQ（表达p54、p30 和CD2v胞外端蛋白）和pCMV-UbsHAPQ（表达与泛素融合的p54、p30 和CD2v 胞外端蛋白）作为DNA 疫苗。结果发现，仅有用pCMV-UbsHAPQ 免疫的猪能够获得部分免疫保护。因此推测，泛素化CD2v 蛋白可靶向蛋白酶体发生降解，参与MHCⅠ类分子的递呈途径，激活特异性T 细胞免疫。实验证实，经pCMV-UbsHAPQ 免疫后的猪在ASFV 攻击后，体内CD8+T 细胞数量急剧扩增，说明机体产生针对CD2v的特异性T细胞免疫与该疫苗的保护作用相关。以上实验均提示CD2v可以作为ASFV疫苗设计和研发的靶点分子。

引起细胞介导的免疫应答的另一种方法是使用病毒载体。BacMam 是一种基于杆状病毒的载体，通过感染哺乳动物细胞表达靶基因。ARGILAGUET 等［28］构建了承载CD2v、p54 和p30 基因的BacMam-sHAPQ 载体，免疫后通过用ASFV 进行致死性攻击来测试该疫苗的保护潜力。结果发现在ASFV 感染后，免疫的6 只猪中有4 只猪获得了保护性免疫，这种保护作用与疫苗接种后产生的病毒特异性T 细胞有关。这些结果进一步验证了CD2v 在未来疫苗开发中的潜力。

3.2 CD2v 分子的抗原表位研究 BURMAKINA等［29-30］在CD2v中鉴定出了4个T细胞表位，2个位于胞外区，2 个位于胞内区富含脯氨酸的结构域内。应用IFN-γ ELISPOT 实验评估针对不同的CD2v 表位的应答强度：在模型动物被ASFV 攻击7～10 d 后分离出外周血单个核细胞，接着通过IFN- γ ELISPOT 测定这些细胞与CD2v 的不同抗原肽孵育后T 细胞的应答程度。实验发现针对这4 个表位均出现了T 细胞应答，而针对胞内区富含脯氨酸的结构域的T 细胞应答更为强烈，说明这2 个表位是免疫优势表位，也是疫苗设计的良好靶点。

MINMA 等［31］对ASFV 分离株Georgia 2007/1 的CD2v蛋白主要序列进行了计算机分析，使用计算机模拟方法鉴定CD2v 蛋白的B 细胞和T 细胞表位。通过计算机预测，在CD2v蛋白胞外区（17 aa～204 aa）中鉴定出了4 个B 细胞表位和5 个T 细胞表位。对鉴定出的B 细胞和T 细胞表位进行保守性分析后绘制了CD2v 蛋白序列中免疫表位分布的图谱，为针对CD2v抗原的疫苗设计提供了帮助。

4 CD2在ASFV基因分型中的作用

SANNA 等［32］提出将CD2v 蛋白C 端重复六肽序列的基因作为一种新的遗传标记，对来自不同地区的ASFV 进行基因分型，借此追踪病毒毒株的起源与传播。针对大量的撒丁岛ASFV 样本，对ASFV 中编码p72蛋白、p54蛋白和中央可变区的基因进行分析，发现不同病毒分离株的这些基因并无区别。但不同病毒毒株CD2v C 端重复六肽序列的重复数目不同，其基因长度可用于不同病毒毒株的鉴别。MOLINI等［33］也证明CD2v C 端重复六肽序列可对纳米比亚ASFV 进行分型。因此，CD2v 可以作为不同ASFV病毒毒株的鉴别标志。

5 小结及展望

CD2v 作为一种结构蛋白，在ASFV 复制、体内播散和免疫逃逸中发挥着重要的作用。CD2v 可以通过介导红细胞吸附增加ASFV 在宿主中的播散；C 端能帮助病毒定位VF 促进病毒的复制；它还可以与SH3P7 蛋白和AP-1 蛋白相互作用参与病毒的免疫逃逸。对CD2v 蛋白结构和功能的解析促进了它的应用研究。研究人员以CD2v 为靶点进行了减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA 疫苗和病毒载体疫苗的研究，以CD2v 的C 端为遗传标记进行ASFV 基因分型。

但是对于CD2v 蛋白的结构解析和功能还有许多未解之处：比如目前只解析出CD2v 在体内能够被加工成3 种形式，但是并没有确定加工位点及加工后产物的功能。CD2v 蛋白介导感染细胞与红细胞的黏附，但是它位于红细胞上的受体尚未找到。CD2v 蛋白C 端的重复六肽序列PPPKPC 和富含脯氨酸的酸性结构域是ASFV 的特异性序列，它们的功能也尚未明确。CD2v 蛋白介导病毒的免疫逃逸机制仍未完全证实。对于这些问题的进一步解决可以帮助人们更加深入地了解ASFV，为非洲猪瘟的防治提供帮助。