环状RNA在自身免疫性疾病中的研究进展①

吴亚彬 刘建华 秦晓松 （中国医科大学附属盛京医院检验科，沈阳110004）

环状RNA（circRNA）是一类新型长链非编码RNA，与线性RNA不同，circRNA 形成共价闭合的连续环并在哺乳动物中充当基因调节剂。1976 年，在病毒中首次鉴定出 cricRNA［1］。circRNA 主要通过反向剪接或套索形式产生，其环化结构可抵抗RNA核酸外切酶降解，具有高稳定性。生物体内，circ-RNA具有2个显著特性：高度保守及半衰期较长，因此可稳定地存在于外泌体和血浆［2-3］。就人类疾病诊断而言，circRNA 可能优于miRNA 和lncRNA。通常，免疫细胞具有可区分自身（即天然结构）和非自身或异常自身（即病原体或肿瘤抗原）的受体，从而使其能够发现病原体或恶性转化细胞。免疫细胞在精确调节部分免疫相关基因同时，促使生物体对病原体产生强大免疫能力，并限制其对自身抗原的免疫力。因此，当人体免疫力平衡时可有效抵御外界感染及损伤，而当机体免疫失调时则可导致炎症反应加重，甚至引发自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、干燥综合征等［4-5］。已有研究指出，miRNA 在免疫反应中具有重要作用［6］。随着高通量测序技术发展，逐渐发现circRNA 在免疫性疾病中同样发挥重要作用。circRNA 具有多个可与miRNA 结合的位点，因此能够通过吸收miRNA 发挥作用，并通过碱基配对影响其他 RNA［7］。另外，circRNA 能够与不同下游蛋白质结合，从而抑制蛋白活性。本文结合circRNA 的国内外最新研究进展，阐述circRNA 形成机制、分类、功能及其在自身免疫性疾病中的作用，以期为自身免疫性疾病诊断及治疗提供新思路。

1 circRNA形成机制、分类和功能

1.1 circRNA 形成机制 circRNA 通过对初级RNA的反向剪接或套索机制产生［8-9］。与线性RNA不同，通常存在于RNA 分子两端的3'和5'末端通过共价键连接导致环化。生物体内，反向剪接比套索机制更为常见，反向剪接可伴随转录，也可在转录后发生［10-11］。反向剪接与套索机制具体表现为以下3 种形式：外显子跳跃、内含子配对驱动环化及RNA 结合蛋白（RBP）驱动环化。外显子跳跃产生包含跳过外显子的套索结构，不但能够产生稳定的含外显子的circRNA，还产生1个不含跳过外显子的线性转录本［12］。内含子配对驱动环化是基于外显子侧翼的内含子反向互补匹配，不同于环化外显子跳跃机制。反向互补匹配可诱导侧翼内含子间碱基配对，促进发夹形式形成，使外显子5'和3'末端进入临近空间，并诱导“头对尾”拼接，此过程中，作用于RNA的腺苷脱氨酶（adenosine deaminases acting on RNA，ADARs）发挥重要作用，但此酶将通过对双链RNA分子中的腺苷转化为肌酐分子解压缩双链RNA 分子，从而减少circRNA 形成［13］。除单纯内含子和外显子参与circRNA 形成外，一些RNA 结合蛋白也可促进circRNA 形成。如果蝇研究发现，剪接因子Musblindblind（MBL）通过与 circMBL 序列侧翼的内含子内的MBL结合位点特异性结合，驱动MBL的第2 个外显子环化产生circMBL［14］。前列腺癌研究发现，RNA 剪接因子HNRNPL 参与其中，类似于果蝇研究中发现的剪接因子 MBL［15］。

总之，RNA 出现断点后，在反向确认中诱导上游5′剪接供体位点与下游3′剪接受体位点连接，最终生成circRNA。不同断裂点位置决定circRNA 组件的多样性，表明circRNA 可被外显子、内含子、基因间区域、非转录区域随机组合环化而形成［16］。

1.2 circRNA 分类 根据circRNA 所形成的内部元素可将circRNA 分为3 类：外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA，其中，人类组织相关研究中，约80%~90%circRNA 来自外显子基因序列，外显子 circRNA 通常由 1~5 个外显子组成［17］。另外，circRNA 可来源于单个宿主基因，包含相同的反向剪接连接，形成多个circRNA同工型。

1.3 circRNA 功能 目前circRNA 研究发现，外显子circRNA 主要通过结合miRNA 的海绵机制实现其功能。CDR1as 上有63 个miRNA-7 结合位点，因此，将CDR1as称为“miRNA 海绵”，通过吸附miRNA分子增强miRNA靶基因水平。

与外显子circRNA 不同，含有内含子的circRNA位于细胞核，主要参与基因转录调节。ZHANG等［18］研究发现，源自ankrd52 第2 个内含子的ci-ankrd52，其功能可能取决于1 个共有序列，该序列在其5'剪接位点附近含有1 个富含GU 的7 核苷酸片段，以及靠近分支部位处富含C 的11 核苷酸片段，可防止内含子circRNA 分解，ci-ankrd52 主要在细胞核中积累，通过RNAPol2顺式调节作用促进ankrd52转录。

circRNA 除充当miRNA 海绵与基因转录调节外，还可通过与相应蛋白相互作用发挥作用。如circ-foxo3 通过与p21 和Cdk2 蛋白形成三元复合物阻止细胞周期［19］。癌症相关性研究发现，癌细胞系高表达circRNA circ-Amotl1，增加致癌蛋白c-myc 核保留，从而提高致癌蛋白稳定性，并增加其与多种启动子结合的亲和力，上调c-myc揭示了circRNA 在肿瘤发生中的新功能［20］。另外，circRNA 还可与其同源mRNA 竞争RNA 结合蛋白HuR，此蛋白能够与多种RNA相互作用调节蛋白表达［21］。

虽然circRNA 定义为非编码RNA，但有研究指出，真核生物核糖体可在circRNA 上启动翻译，但仅当RNA 包含内部核糖体进入位点（或IRES）元件时才可启动翻译［22］。最近，CHEN 等［23］建立 circRNA参考数据库时，注释了具有蛋白质编码潜力的circ-RNA 内部核糖体进入位点和开放阅读框（ORF），还提供了其通过质谱的蛋白表达证据，并分析从circRNA 翻译的蛋白特征，包括结构域、N-糖基化位点、黏蛋白型O-糖基化位点和磷酸化位点。

2 circRNA在自身免疫性疾病中的作用

自身免疫性疾病是异质性疾病，主要表现为免疫系统受损及自身抗原免疫耐受丧失。虽然现在仍不清楚其分子机制，但多数研究表明，环境因素及表观遗传失调导致易感人群发病。随着circRNA研究深入，发现其与免疫性疾病密切相关，不仅参与自身免疫性疾病发病机制，还可做为检测自身免疫性疾病的非侵入性生物标志物［7］。

2.1 circRNA 与SLE SLE 是一种慢性、复杂性自身免疫性疾病，常累及全身多个器官，出现严重临床表现，多发病于 20~40 岁育龄期女性［24］。虽然SLE 是免疫系统介导的疾病，但具体致病机制仍未明确。LI 等［25］采用人 circRNA 微阵列技术测量 SLE患者与健康对照者T 细胞中circRNA 表达谱，鉴定出127 种差异表达circRNAs。通过定量PCR 验证，SLE 患者T 细胞中hsa_circ_0045272 表达下调。敲低hsa_circ_0045272 导致Jurkat 细胞早期凋亡明显增加，ELISA 验证发现，敲低 hsa_circ_0045272 显著促进激活的Jurkat 细胞IL-2 产生。同样，ZHANG等［26］采用 circRNA 微阵列技术分析 SLE 患者和健康对照的CD4+T 细胞发现，SLE 患者有12 个circRNA上 调 ，2 个 circRNA 下 调 。 上 调 的 circRNA 中hsa_circ_001 2919 变化异常明显。SLE 患者CD4+T细胞中，自身免疫相关基因CD11a 和CD70 表达异常升高与其启动子区DNA 低甲基化密切相关［26］。将靶向hsa_circ_0012919 的siRNA 导入细胞可明显减少其表达，hsa_circ_0012919 下调增加SLE 患者CD4+T 细胞中 DNA 甲基转移酶 1（DNMT1）表达，同时降低CD70 及CD11a 表达。由此得出，hsa_circ_0012919 下调可逆转SLE 患者CD4+T 细胞中CD11a和CD70 启动子区DNA 甲基化不足。另外，hsa_circ_0012919可通过与miR-125a-3P结合调节正常T细胞表达及其RANTES与Kruppel样因子13（KLF13）分泌。SLE 患者碱性粒细胞向RANTES 和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）迁移速率明显提高，可能与SLE患者组织损伤有关［27］。KLF13 可正向调控RANTES，并与CD4+T细胞中IL-4表达有关［28］。

GUO 等［4］采用二代测序分析 SEL 患者外周血单个核细胞（PBMC）中circRNA 表达谱，并按其疾病活动特征（稳定或活跃SLE）和健康对照进行分层，发现与健康对照组相比，SLE 患者PBMC 中仅hsa_circ_0000479 显著上调。经过验证阶段及外部验证阶段队列中，hsa_circ_0000479表达可作为SLE患者与健康对照组及类风湿性疾病患者诊断标志物。生物信息学分析显示，hsa_circ_0000479 通过调节代谢途径和Wnt 信号传导途径调节SLE 进展。Western blot 显示，SLE 患者 Wnt-16 蛋白表达显著降低。此外，18 例SLE 患者和10 例健康对照者PBMC中 hsa_circ_0049224、has_circ_0049220 和 DNMT1 表达研究发现，健康对照组hsa_circ_0049224 和has_circ_0049224 表达均显著高于非活动和活动性SLE患 者［29］。DNMT1 表 达 与 hsa_circ_0049224 和 has_circ_0049220表达呈正相关。此外，SLE疾病活动指数（SLEDAI）与hsa_circ_0049224和has_circ_0049220表达呈负相关。

此外，SLE 患者血浆中circRNA 同样发生改变，如 LI 等［30］对 SLE 血浆进行 circRNA 谱筛查，确认hsa_circ_400011、hsa_circ_102584、hsa_circ_101471和hsa_circ_100226 发生失调，但样本量少及未进行其他人群筛查，缺乏诊断SLE 特异性。狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）新型生物标志物研究发现，LN患者血浆 circRNA-002453 水平显著升高［31］。与 RA患者和健康对照组相比，SLE 患者血浆circRNA-002453 表达上调，且其表达与24 h 蛋白尿和肾脏SLEDAI 评分显著相关。因此，LN 患者血浆circRNA-002453 水平上调与肾脏受累程度有关，可作为LN患者诊断的潜在生物标志物。

2.2 circRNA 与类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA） RA 是一种具有多种病因的高度流行慢性疾病，其重要特征为多个关节普遍受累发炎，导致软骨和骨侵蚀及关节变形，主要由遗传易感性和环境刺激导致［32］。标志性自身抗体主要有类风湿因子、抗环瓜氨酸肽2及抗氨基甲酰化蛋白抗体等，但这些抗体变化与疾病活动度评分或长期治疗反应无关，仅可反映免疫抑制强度，因此寻找更多潜在生物标志物对RA治疗非常重要［33］。

研究发现，RA 与健康对照组单个核细胞数无显著差异，circRNA 微阵列分析和qRT-PCR 验证发现 ，RA 患 者 PBMC 中 circRNA-092516、circRNA-003524、circRNA-103047、circRNA-104871 和 circRNA-101873 与健康对照差异明显［34］。circRNA-104871 显示出最高的ROC AUC 值，其作为诊断生物标志物潜力较大，但由于样本量小及未与其他自身免疫性疾病进行对比研究，本实验结果需进一步研究。同时，ZHENG 等［35］研究发现，RA 与健康患者外周血单个核细胞中，hsa_circ_0092285、hsa_circ_0058794 显著升高，而 hsa_circ_0088088、hsa_circ_0038644 显著降低，其中hsa_circ_0088088 变化最为显著。作为miRNA 的海绵，circRNA 可竞争性结合并抑制相应miRNA，从而增加相应miRNA 靶标。miRNA 在疾病进展具有组织及阶段特异性，miRNA参与RAMMP 产生、白细胞活化、炎症反应和滑膜细胞增殖［36］。hsa_circ_0088088 作为 hsa-miR-16-5p 的海绵，当hsa_circ_0088088 显著降低时，hsa-miR-16-5p明显升高，miR-16参与细胞凋亡和自噬调节［37］。

除对 RA 进行 PBMC 中 circRNA 筛查研究外，LI等［38］首次将RA 滑膜组织与正常滑膜组织进行层次聚类分析，并经功能分析研究表明，circRNA 是导致基因表达差异的重要因素。hsa_circ_0001859 通过充当海绵直接抑制miR-204/211 转录，从而充当调节ATF2 表达的诱饵。ATF2 为CREB 家族成员，通常与AP1（c-Jun和c-Fos）和异二聚体相关，在骨骼系统、中枢神经系统和炎症中起重要作用［39］。在SW982 细胞中进行验证，siRNA 沉默hsa_circ_0001859可抑制ATF2表达并降低其炎症水平。

2.3 circRNA 与多发性硬化症（multiple sclerosis，MS） MS 是中枢神经系统的一种慢性自身免疫性疾病，早期阶段发生炎症、脱髓鞘及轴突丢失，免疫、遗传、组织病理学研究和治疗试验结果表明，免疫系统在MS疾病过程中起关键作用［40］。

通过在MS 基因组范围内的相关基因座中寻找非编码元件可能的富集区，PARABOSCHI 等［41］发现，非编码元件富集较多，尤其在包含MS 相关单核苷酸多样性（SNP）的73 个连锁不平衡区块（LD）中具有丰富的环状RNA，并验证与MS 相关位点即STAT3 基因所表达的hsa_circ_0043813 3 种基因型进行SNP 相关调节，首次表明MS 全基因组相关研究最高变异区位于富含circRNA 的不平衡的区块。另外，替代剪接异常已成为自身免疫性疾病的复发特征，剪接调控基因普遍缺陷与MS 密切相关。CARDAMONE 等［42］研究发现，与健康对照组相比，复发缓解型MS 患者外周血单个核细胞中替代剪接亚型与鉴定出的circRNA 均明显失调。RNA异常参与该疾病发生。另一项研究发现，与健康组相比，MS 患者外周血白细胞中有406 个差异表达的circRNA，其中 hsa_circ_0035560 和 hsa_circ_0005402在疾病早期即表达下调，且两者均位于膜联蛋白A2（ANXA2）基因内部的 15 号染色体［43］。已报道ANXA2 是 miR-155 的靶标，miR-155 是血脑屏障神经炎症中的关键miRNA，与MS 中Th1 和Th17 细胞分化及髓样细胞极化有关，MS 患者和EAE 小鼠中，miR-155 在外周血单个核细胞和活动性病变中显著增加，并与疾病严重程度相关［44］。

2.4 circRNA 与原发性干燥综合征（primary Sjögren's syndrome，pSS） pSS 是一种炎症性疾病，主要破坏口腔与眼睛腺体，但pSS 患者有时会出现腺体外表现，如肾小管间质性肾炎和自身免疫性肝炎，主要通过自身抗体过表达介导，可能导致高球蛋白血症。pSS 病因尚未阐明，但同其他自身免疫性疾病一样，遗传和环境因素对pSS 发生发挥重要作用。

通过对外周血中单个核细胞进行circRNA 表达微阵列分析发现，与健康个体相比，pSS 患者hsa_circRNA_001264 和 hsa_circRNA_104121 表达上调，hsa_circRNA_045355表达降低［5］。并且，与晚期患者相比，早期pSS 患者hsa_circRNA_001264 和hsa_circRNA_104121 表达较高，hsa_circRNA_045355 表达下调，且3 种circRNA 表达失调与疾病活动指数密切相关。circRNA 可竞争性结合并抑制相应的miRNA。hsa_circRNA_104121 可结合并抑制miR-203a-3p 和 miR-143-3p，在 pSS 患 者 中 hsa_circRNA_104121 表达升高。口腔健康不良患者唾液中miR-203a-3p表达更高［45］。RA滑膜组织中miR-143-3p表达显著高于对照组，抑制miR-143-3p 表达可抑制细胞增殖，降低炎症细胞因子水平并促进细胞凋亡，首次揭示了pSS患者circRNA异常表达特征［46］。

2.5 circRNA 与原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC） PBC 是一种罕见的慢性自身免疫性胆汁淤积性肝病，其特征为淋巴细胞浸润导致肝内胆管小导管逐渐破坏，最终演变为肝纤维化。PBC 发病机制复杂，涉及遗传、环境、自身免疫和其他因素，但机制尚未阐明。

ZHENG 等［3］首次分析 PBC患者血浆 circRNA 发现，与健康对照组相比，PBC 患者有22 种差异表达的circRNA，其中hsa_circ_402458 在候选生物标志物中表现出最大的PBC 表达差异和最高诊断价值。ceRNA 分析推测显示，hsa_circ_402458 可能靶向hsa-miR-522-3p 和 hsa-miR-943。miR-522-3p 可能与炎症异常消退有关，且可能是调节慢性炎症性疾病的靶标，miR-522-3p可与SFRP2的3'-非翻译区直接结合，该区域通常被认为是Wnt 信号的抑制剂［47］。另外，miR-943 通过 TGF-β 信号通路参与 DNA 双链断裂修复，但异常的TGF-β1 信号传导在小鼠模型中促进 PBC 发展［48］。因此，假设 hsa_circ_402458 可能起miRNA 海绵作用，并通过影响炎症相关信号通路参与PBC 发病，但这些miRNA-circRNA 轴在PBC发病机理中的潜在功能需进一步研究。

2.6 circRNA 与溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC） UC 是结肠慢性炎症性疾病，通常表现为腹痛、腹泻及便血，童年即可发病，成年达高峰［49］。排除传染性病因，贫血和红细胞沉降率或C 反应蛋白水平升高即可提示为UC，但目前实验室指标未发生变化并不能排除为UC。

采用微阵列检测技术比较分析活动性UC 患者病变部位肠黏膜细胞与非病变黏膜细胞发现，病变黏膜有264 种显著失调的circRNA 和1 869 种差异表达 mRNA，其中 hsa_circ_0004662 和 hsa_circ_0007919 在UC 组织中变化最为显著，hsa_circ_0007919 在炎症治疗后持续减少，并与Mayo 内镜下评分和紧密连接分子表达密切相关［50］。miR-138 在UC 炎症性黏膜中明显增强，由于miR-138 可干扰VIPR1 mRNA，抑制其合成，但VIPR1 缺失加速UC炎症进展［51-52］。hsa-miR-301a 在 UC 中表达上调，并通过降低BTG1 水平破坏上皮完整性［53］。炎症细胞因子IL-22 诱导的肠上皮细胞（IECs）炎症中，lncRNA H19 抑制let-7 表达，促进上皮细胞增殖和再生［54］。circRNA-miRNA-mRNA 网络显示，hsa-circ-0007919 可与 hsa-miR-301a、hsa-miR-138、hsa-miR-20b 和 hsa_let_7a 结合，因此，调节 hsa_circ_0007919表达可能有助于肠道屏障恢复，并可作为UC 治疗的新方法。

2.7 circRNA 与特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN） IMN是一种独特的肾小球病变，是成人肾病综合征的最常见病因。多数IMN 患者均具有针对足细胞膜抗原PLA2R 的循环IgG4 自身抗体（70%），尽管血清PLA2R 抗体水平（15%）或近期抗THSD7A（3%~5%）为阴性，但活检PLA2R染色阳性时，仍具有近期免疫学活性，但剩下的10%患者无可证实的抗PLA2R/THSd7A 抗体或抗原，因此，急需寻找潜在的诊断标志物［55］。

外泌体具有双层质膜结构，并携带丰富蛋白、mRNA 和miRNA，可由树突状细胞、肿瘤细胞及其他细胞释放至细胞外微环境［56］。研究表明，外泌体在急性肾损伤、糖尿病肾病、肾小管酸中毒、多囊肾等肾脏疾病中发生特异性变化［57-60］。MA 等［61］首次将外泌体与circRNA 在IMN 中进行研究，发现IMN患者血清和尿液外泌体中circRNA 表达异常，这些差异表达的circRNA 主要为内含子衍生的circRNA，其相应基因可编码部分小核仁RNA（snoRNA）。snoRNA 经进一步加工可形成较短的RNA 片段，具有类似miRNA 的功能，因此，snoRNA 可充当miRNA前体，在转录过程前及转录中修饰mRNA，并在mRNA 水平调节基因表达［62］。但疾病中差异表达的circRNA的特定机制和功能需进一步研究。

3 展望

越来越多证据表明，circRNA 是免疫细胞发育及多个免疫调节阶段的重要参与者。与癌症研究类似，circRNA 在免疫疾病中的研究需要检测circ-RNA 表达，阐明差异表达circRNA 的功能及其潜在机制。分析circRNA 差异变化有助于探索circRNA调节免疫反应机制，有望成为新型生物标志物及治疗靶点。由于circRNA 功能复杂，尤其circRNA 可能作为miRNA海绵调节多种生物学过程，包括DNA甲基化、免疫反应及炎症反应，但目前在自身免疫性疾病中的研究并不充分，许多方面仍处于初级阶段。因此，进一步研究circRNA 的分子形成机制、降解机制及参与疾病发生的详细机制具有重要价值。