过敏毒素C5a在痛风性关节炎患者中的表达及意义

刘 静 罗釆南 王 丹 陈 勇 袁佳利 罗雄燕 （川北医学院附属医院，南充 637000）

痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）是一种最常见的晶体沉积性关节炎，主要由超饱和度的尿酸盐在关节内和关节周围组织中沉积所引起。尿酸盐在关节和关节周围沉积导致大量中性粒细胞渗入关节组织，吞噬尿酸盐结晶后释放大量炎症介质，继而造成关节红肿热痛。过敏毒素C5a是补体成分5（the fifth component of complement，C5）在被激活过程中形成的活性片段，在炎症过程尤其是在趋化中性粒细胞迁移到炎症部位过程中发挥极为重要的作用［1］，但 C5a 是否与 GA 中大量中性粒细胞在受累关节的聚集有关，目前报道较少。本文通过检测急性GA患者血清和关节液中的C5a浓度，并分析其与临床和实验室指标的相关性，旨在探讨C5a在GA发生中的作用。

1 资料与方法

1.1 资料 纳入 2019 年 2 月至 2019 年 11 月在川北医学院附属医院、四川大学华西医院和新疆维吾尔自治区人民医院风湿免疫科确诊为GA 的患者37 例，其中男 36 例，女 1 例，年龄 16~65 岁，平均40.4 岁；从GA 首次发作到本次就诊时的病程为1 d~75 个月，平均18.4 个月。本次发作后到就诊时的时间间隔为1~9 d，平均2.7 d。所有患者均符合2015 年美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）痛风分类标准［2］。纳入28 例膝骨关节炎（osteoarthris，OA）作为疾病对照组，其中男19 例，女9 例，年龄 46~63 岁，平均 51.2 岁，均符合 2010 年EULAR 膝OA 的诊断分类标准［3］。详细收集所有患者的临床资料，包括症状、体征、实验室检查结果以及检查前的药物治疗情况。另纳入30例年龄、性别匹配的健康体检者作为正常对照组。

1.2 方法

1.2.1 GA 受累关节评估 对GA 受累关节的疼痛评分采用视觉模拟尺（VAS）进行自我评价；参照文献［4］方法对患者进行关节压痛评分及关节肿胀评分。

1.2.2 关节液尿酸盐晶体检查 21 例GA 和20 例OA 患者行膝关节穿刺术，在无菌条件下以膝关节髌骨上缘为穿刺点，进针后抽取关节液，取部分送检常规化验、细菌学检查和尿酸盐晶体检测，剩余部分1 000 g 离心15 min，收集上清液置-30℃保存备用。尿酸盐晶体检查：取20 μl新鲜关节液滴加到载玻片上，盖上盖玻片后置偏振光显微镜（上海缔伦光学仪器有限公司）下观察，在10×40高倍视野下随机取10 个视野，对双折光针状晶体计数，取平均值。

1.2.3 C5a 检测 分别抽取上述患者及对照者空腹静脉血2 ml，4℃静置30 min，待血凝后1 000 g离心15 min，收集血清于-30℃保存备用。C5a 的检测采用酶联免疫吸附法（ELISA），操作按试剂盒［北京义翘神州科技有限公司（KIT10604）］说明书中的步骤进行。待测样本（血清和关节液）按1∶2 稀释，根据标准品的OD 值绘制曲线，并据此计算所测样本的C5a浓度。

1.2.4 C5a 体外诱发试验 按文献报道的方法配制尿酸单钠晶体悬液［5］，简要步骤如下：取 0.5 g 尿酸（Sigma 公司）加入到100 ml 的12%NaOH 溶液中，磁棒搅匀后用盐酸调整pH 为7.2，于120℃烤箱中放置6 h，取出冷却至室温，偏振光显微镜下观察晶体形成情况后置4℃保存备用。取健康对照者的新鲜血清，加入尿酸单钠晶体悬液，分别至尿酸终浓度为0.01、0.1、1 mg/ml，对照组加等体积的PBS 溶液，37℃ 孵育10 min，取100 μl上述溶液ELISA方法检测C5a浓度。

1.3 统计学分析 所有数据采用SPSS23.0软件包进行分析。组间比较采用t检验或秩和检验，相关性采用 Pearson 或 Spearman 分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GA 患者血清和关节液中C5a 浓度升高 GA患者血清C5a 浓度（34.7±19.1）ng/ml 明显高于健康对照组（17.0±6.7）ng/ml（t=5.24，P=0.000）和OA患者（Z=-3.91，P=0.000），见图1，GA患者关节液中C5a浓度为（43.3±23.3）ng/ml，显著高于配对血清中 C5a 浓度（36.1±20.6）ng/ml（t=-2.47，P=0.023）和 OA 患者关节液中 C5a 浓度（24.5±12.0）ng/ml（t=3.27，P=0.003），而C5a浓度在OA患者的血清和关节液中差异无显著统计学意义（t=0.11，P=0.912）。

图1 健康对照组（HC）、痛风性关节炎（GA）和骨关节炎（OA）血清和关节液中C5a浓度检测结果Fig.1 C5a concentration in serum and synovial fluid of healthy control group（HC），gouty arthritis（GA）and osteoarthritis（OA）

2.2 C5a 浓度与临床指标的相关性分析 GA 患者C5a 浓度与临床症状和实验室指标见表1，血清C5a浓度与患者疼痛程度无明显相关性联系（r=0.11，P=0.622，图2A），但与受累关节的压痛（r=0.49，P=0.023，图2B）和肿胀（r=0.57，P=0.007，图2C）程度呈显著正相关。

表1 GA患者C5a浓度与临床症状和实验室指标相关性分析Tab.1 Correlation analysis of GA patients' C5a concen⁃tration with clinical symptoms and laboratory indi⁃cators

图2 GA患者血清C5a浓度与临床指标的相关性分析Fig.2 Correlation analysis of GA patients' serum C5a concentration with clinical symptoms

2.3 C5a 浓度与实验室指标的相关性分析 血清C5a 浓度与血尿酸浓度（r=0.09，P=0.592，图3A）、WBC 计数（r=0.31，P=0.063，图3B）呈现正相关趋势，但均无统计学意义，仅与CRP 浓度存在相关性联系（r=0.37，P=0.024，图3C）。而关节液中C5a 浓度则与关节液WBC 计数呈现显著相关（r=0.55，P=0.009，图4A）。虽然血尿酸浓度与血清C5a 浓度不存在统计学意义的相关性，但关节液中尿酸盐晶体负荷与关节液C5a浓度密切相关（r=0.47，P=0.033，图4B）。

图3 GA患者血清C5a浓度与实验室结果的相关性分析Fig.3 Correlation analysis between C5a concentration of serum and laboratory results in GA patients

图4 GA患者关节液C5a浓度与实验室结果的相关性分析Fig.4 Correlation analysis between C5a concentration of synovial fluid and laboratory results in GA patients

2.4 体外尿酸单钠晶体诱导C5a 生成 鉴于观察到血尿酸浓度与血清C5a 浓度无关，而关节液中尿酸盐晶体数量与关节液C5a 浓度密切相关，提示尿酸盐晶体可能刺激C5a的生成，为验证这一可能性，在体外对尿酸单钠晶体诱导C5a生成的情况进行了研究，结果显示：尿酸单钠晶体以剂量依赖性方式促进C5a生成（表2、图5）。

表2 MSU体外诱导C5a生成Tab.2 C5a induced by MSU in vitro

图5 体外尿酸单钠晶体对C5a生成的影响（n=9）Fig.5 Effect of monosodium urate crystals on C5a pro⁃duction in vitro（n=9）

3 讨论

补体C5 是补体系统中的重要组分，由a、b 两条多态链通过二硫链相连组成，分子量190 kD，在补体激活过程中，经C5 转化酶作用后裂解成115 kD的 C5a 和 75 kD 的 C5b 两个活性片段。C5a 在炎症过程中的作用已被大量研究证实，类风湿关节炎、银屑病关节炎等炎性关节疾病均发现有C5a浓度增高，C5a 可促进炎症细胞在关节液的渗出，以中性粒细胞更甚［1，6］。虽然临床观察到，GA 的关节液中中性粒细胞数升高较类风湿关节炎和银屑病关节炎更明显，但目前有关C5a在GA发生中的作用报道较少，为此本研究对GA 患者进行了C5a 浓度的检测，并对其临床和实验室指标进行了分析，结果显示：GA 患者血清C5a 浓度明显高于健康对照组（P=0.000）和OA 患者（P=0.000），而且增高的C5a 浓度与关节压痛指数（r=0.49，P=0.023）、关节肿胀指数（r=0.57，P=0.007）和炎性反应指标 CRP（r=0.37，P=0.024）存在显著的正相关，提示血清C5a 浓度可以作为判断 GA 炎症程度的指标。DOHERTY 等［7］和 BRODEUR 等［8］分别在 GA 患者关节液中检测到补体成分3（C3）、补体成分4（C4）和C5 的活性片段C3a、C3d、C4d 及 C5b-9，加之本文检测到的C5a，说明补体系统参与GA的发生过程。

对关节液C5a浓度进行分析，结果显示GA患者关节液C5a 浓度高于血清浓度（P=0.023），表明C5a可在炎性关节内产生。进一步的分析发现，GA 患者关节液C5a 浓度与关节液WBC 计数呈现显著正相关，证实C5a 在趋化WBC 浸入关节部位中发挥重要作用。值得注意的是，虽然本文观察到GA 患者血尿酸浓度与血清C5a 浓度并无相关性联系（r=0.09，P=0.592），但GA 患者关节液中尿酸盐晶体量则与关节液C5a 浓度呈现显著正相关（r=0.47，P=0.033），结合GA患者关节液C5a浓度高于血清中浓度这一现象，推测尿酸盐晶体而不是可溶性尿酸可促进C5a 的生成。为验证这一可能，在体外对尿酸单钠晶体诱导C5a 生成情况进行研究，结果证实尿酸单钠晶体可以以剂量依赖性方式促进C5a 生成。RUSSELL 等［9］的研究证实，尿酸单钠晶体诱导 C5a生成与尿酸单钠晶体表面有C5转化酶形成有关。

BROVOLD 等［10］观察到只有尿酸盐晶体而不是可溶性尿酸可刺激单核细胞表达TNF-α、IL-1β、MCP-1 和IL-8，表明尿酸盐结晶而非尿酸是促炎症反应的元凶，临床观察证实GA 由尿酸盐晶体在关节部位的沉积所诱发，本文也在GA 关节内发现有大量尿酸盐晶体存在。近几年对GA 的分子病理机制研究证实，尿酸盐晶体通过激活NLRP3 炎症体，进而将IL-1β 前体转化成活性IL-1β，由此促发炎症反 应［11］。 但 BAUERNFEIND 等［12］和 KHAMENEH等［13］的研究结果表明，尿酸盐晶体单独并不能激活NLRP3 炎症体，只有当单核细胞/巨噬细胞预先暴露在细菌脂多糖、穿孔毒素及致炎细胞状况下，尿酸盐晶体才能激活 NLRP3 炎症体。AN 等［14］发现，单核细胞用C5a预处理后加入尿酸单钠晶体可引起NLRP3 炎症体的激活，导致大量 IL-1β 产生，C5a 拮抗剂可阻断这一作用。KHAMENEH 等［13］在尿酸单钠晶体诱导的鼠腹膜炎巨噬细胞中也观察到C5a的这一作用。CUMPELIK 等［15］在尿酸单钠晶体诱导的鼠腹膜炎中进一步发现，虽然C5aR+/+小鼠和C5aR-/-小鼠在注射尿酸单钠晶体后均有大量C5a 的生成，但仅在C5aR+/+小鼠观察到NLRP3炎症体的激活，并伴随大量IL-1β产生，提示C5a通过与其受体结合促进尿酸盐晶体激活NLRP3 炎症体。这些结果表明，C5a在尿酸盐晶体诱导的NLRP3炎症体激活中发挥至关重要的作用［16］，由此也可以解释本文观察到的C5a浓度与GA炎症程度相关这一现象。

综上所述，尿酸盐晶体可诱发C5a的生成，而增高的C5a浓度与GA患者关节压痛指数、关节肿胀指数、炎症反应指标CRP、关节液WBC 计数存在显著的正相关性，表明血清C5a浓度可以作为判断GA炎症程度的指标。