小分子核糖核酸在恶性胸膜间皮瘤的研究进展①

江 杰 韩 丹（昆明医科大学第一附属医院医学影像科，昆明 650032）

恶性胸膜间皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）是一种来源于浆膜间皮细胞的高度恶性肿瘤，发病率逐年升高，其发病机制尚未完全阐明，公认的主要致病因素是石棉暴露［1-2］。MPM早期常无任何临床症状及体征，出现异常时多处于肿瘤中晚期，严重影响患者生存质量及预后。目前临床上仍缺乏有效手段来早期诊断MPM、评价疗效及评估预后。随着现代医学生物技术的发展，一些生物标记物正不断被发现对MPM高危人群的筛查、早期诊断、疗效评价、预后评估均有不同的价值。研究报道关于MPM生物标记物有20余种，其中小分子核糖核酸（MiRNAs）是目前研究最为热点的标记物之一。因此本文就MiRNAs在MPM的应用做一综述。

1 MiRNAs对MPM的作用机制

MiRNAs是一种小分子非编码RNA序列，在不同类型的癌症中用作诊断和预后的标记物，有研究提出以MiRNAs为基础治疗癌症的新治疗手段［3-4］。近年MiRNAs的作用正逐渐引起关注，相关研究也较多［5］。参与基因表达转录后调控的MiRNAs在间皮瘤生物学中被发现在癌细胞和血清中表达失调，在不同组织类型肿瘤存在表达差异。研究发现MiRNAs可影响细胞生长的任一过程，包括细胞增殖、凋亡和迁移［3］。特异性MiRNAs表达的改变与包括癌症在内的多种人类疾病有关。值得注意的是，MiRNAs在不同来源的健康组织和癌症组织中的差异表达已经被描述，证实了MiRNAs在癌症发病机制的多个方面起作用，涉及肿瘤的建立到进展、转移和对治疗的耐药性等［6］。因此MiRNAs特异性表达特征可能与不同的患者预后或对治疗方法的反应有关。MiRNAs可在多种生物液体中被量化，如血液、脑脊液、尿液和唾液。由于具备这些特性使MiRNAs成为一种诊断、疗效评价、预后评估的生物标记物［7］。

GULED等［8］于2009年首次提出MiRNAs用于MPM，通过使用miRNA微阵列技术分析MPM与正常心包，证实了MPM的MiRNAs表达与非癌组织不同，分析17个MPM样品，检测723个MiRNAs显示肿瘤组织中let-7e、miR-7-1、miR-9、miR-34a、miR-144、miR-203、miR-340、miR-423、miR-582表 达 较低，而let-7b、miR-30b、miR-32、miR-195、miR-345、miR-483-3p、miR-584、miR-595、miR-615-3p、miR-1228存在高表达。研究采用微阵列方法比较了5个正常胸膜间皮细胞与5个MPM组织样本的MiRNA表达谱，显示miR-17-5p、miR-18a、miR-19b、miR-20a、miR-20b、miR-25、miR-92、miR-106a、miR-106b存在高 表 达，miR-7、miR-182、miR-214和miR-497在MPM中失调［9］。后来也证实部分MiRNAs在目标基因参与调控细胞周期进展。RAMIREZ-SALAZAR等［10］采用PCR芯片分析正常间皮细胞、胸膜慢性炎症、胸膜增生、MPM来鉴定与肿瘤发生相关的MiRNAs表达及其生物学特性网络，发现miR-101-3p和miR-494胸膜慢性炎症和间皮细胞增生表达下调，在MPM组织中miR-181a-5p、miR-101-3p、miR-145-5p、miR-212-3p表达下调，这些MiRNAs的表达下调导致了间质转移相关分子FZDA的表达量增加，转录因子ETS1和信号激活分子MAPK1具有很强的致癌功能。提示胸膜炎症、胸膜增厚与MPM的发生可能存在联系。AK等［11］使用PCR法比较18个MPM胸膜组织和6个具有石棉接触的良性胸腔积液患者的非癌性胸膜组织的MiRNAs表达差异，发现MPM中有11个MiRNAs存在高表达，包括let-7a、let-7d、miR-20a、miR-92a、miR-125a-5p、miR-152、miR-155、miR-193b、miR-320、miR-484和miR-744，研究进一步评估MiRNAs相互作用，发现8个MiRNAs重要的靶向通路，包括两个与NOTCH信号通路相关的通路，MET是MPM中表达最多的基因。TOMASETTI等［12］利用纳米技术评价福尔马林固定石蜡包埋24例MPM样本的800个MiRNAs的表达情况，主要目的是明确MiRNA表达对MDM2-P14/ARF（CDKN2A）-TP53通路的影响，发现MDM2和CDKN2A的表达调控TP53，可能参与了TP53的失活，MiRNAs可能抑制TP53，而MiRNAs对CDKN2A和MDM2本身的影响是轻微的，后又发现调节关键酶的一小部分MiRNAs参与DNA损伤修复。BONONI等［13］研究了MPM不同亚型细胞系的MiRNAs（MS1）表达谱，结果表明有一部分MiRNAs参与了肿瘤进展，其中参与最多的是DDIT4和ROCK2，他们通过激活ErbB-2受体酪氨酸激酶信号通路参与MPM进展过程。上述研究证实MiRNAs参与了肿瘤的发生发展过程，其中多个研究报道了miR-145在MPM组织中表达下调，导致MPM肿瘤细胞增殖和迁移。其他可能涉及的机制包括：①部分MiRNAs表达并且相互作用，导致NOTCH信号通路激活，参与肿瘤发生、发展；②MiRNAs表达通过影响MDM2-P14/ARF（CDKN2A）-TP53通路，参与调控TP53，导致TP53失活；③部分MiRNAs通过激活ErbB-2受体酪氨酸激酶信号通路参与肿瘤进展，其中参与最多的细胞亚群包括DDIT4和ROCK2；④MiRNAs在目标基因参与调控细胞周期进展，MiRNAs的表达下调导致了间质转移相关分子FZDA的表达量增加，转录因子ETS1和信号激活分子MAPK1导致MPM发生，但具体机制尚未完全阐明，还需进一步研究。

2 MiRNAs对MPM筛查、诊断及鉴别诊断的价值

MiRNAs对具有石棉暴露史的高危人群筛查MPM、诊断及鉴别诊断MPM具有重要价值。研究指出血清miR-548a-3p和miR-20a水平的定量是很有前途的新诊断工具，通过qRT-PCR分析对照组、石棉暴露组和MPM患者血清中的MiR-20a和miR-548a-3p在MPM中的表达具有差异，灵敏度均为100%，特异度分别为91.6%和96.7%［14］。CAVALLERI等［15］使用开放阵列方法研究了具有石棉暴露史的19例高危人群和23例MPM患者的754个MiRNAs在胞外质粒中的表达，发现两组间有55个MiRNAs存在表达差异，其中16个MiRNAs在验证阶段经RT-qPCR证实，其中miR-30e-3p、miR-98、miR-103a-3p、miR-148b、miR-744为最具鉴别价值的MiRNA，miR-30e-3p与miR-103a-3p的结合敏感度为95.5%，特异度为80.0%。本研究是唯一一个在血浆外泌体中使用MiRNAs定量的研究。这种新的诊断方法很有意义，因为其可提供大量关于Mi-RNAs的信息释放机制，缺点就是非常昂贵。WEBER等［16］研究证实了miR-103家族作为诊断生物标记物的作用，在后面连续2项工作中，使用2种完全不同的诊断技术，其基础是识别和量化人外周血细胞组分中的MiRNAs，研究人员招募了17例具有石棉暴露史的高危人群和23例MPM患者，利用微阵列分析了328个MiRNAs，发现miR-20a和miR-103存在低表达；定量RT-PCR证实miR-103在MPM患者血液的细胞分数显著下调，区分MPM与健康人群的敏感度、特异度分别为78%、76%，区分MPM与具有石棉暴露史的高危人群的敏感度、特异度分别为83%、71%。该团队的另一项研究采用ELISA法分析52例具有石棉暴露的高危人群和43例MPM男性患者血浆间皮素浓度，采用RT-qPCR法测定两组血细胞分数中miR-103a-3p水平，评估结合miR-103a-3p和定量间皮素诊断MPM的价值，认为间皮素、MiRNA及两者结合起来区分具有石棉暴露史的高危人群和MPM患者的敏感度分别为89%、74%、95%，特异度分别为63%、85%、81%。以上研究表明，MiRNAs对具有石棉暴露史的高危人群诊断具有价值，可用于健康人群与高危人群的筛查，但指标不同，还需要扩大样本量进一步研究。

GULED等［8］证实特定的MiRNA在MPM肿瘤和非肿瘤组织间存在差异，并对组织亚型有一定价值。BENJAMIN等［17］使用微阵列发现不同种类的癌症与MPM的MiRNA组织表达谱存在差异。MPM中miR-193-3p水平较高，而肺原发腺癌miR-192和miR-200c水平较高，敏感度为100%，特异度为94%。GEE等［18］采用微阵列分析了15例MPM和10例肺腺癌组织样本的MiRNA，证实MPM样本中miR-141、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205和miR-429表达低于肺腺癌，可用于鉴别诊断。SANTARELLI等［19］测试了88例MPM活检标本，并与非癌组织对照结果进行比较，发现miR-126在癌组织 中显著下调。AK等［11］研 究 发 现MPM患 者MiRNA明显呈倍数上调，并证实let-7a、miR-125a-5p、miR-320和miR-484能够鉴别与石棉相关的良性胸膜疾病与MPM。此外研究发现胸腔积液细胞定量miRNAs检测在识别新的微创诊断生物标记物方面有很大潜力［20］。首先BIRNIE等［21］利用RT-qPCR方法分析MPM患者的胸腔积液和MPM组织样本中的miRNAs表达，通过对比6例非肿瘤组织和17例肿瘤组织，10例良性肿瘤的胸腔积液和26例MPM的胸腔积液，发现MPM胸腔积液和组织样本中的miR-223水平均显著降低，提示其可用于鉴别诊断。CAPPELLESSO等［22］分析了15个正常胸膜间皮细胞（MeT-5A）和2个MPM肿瘤细胞系（H2052和H28）的miRNAs，在51例MPM和40例非肿瘤的胸膜组织样本，29例肿瘤和24例非肿瘤胸腔积液的细胞学标本中进行MiRNAs检测，发现miR-19a、miR-19b和miR-21在肿瘤样本中高表达，miR-126低表达，在MPM胸腔积液的细胞学成分中同样可以检测到miRNAs，尤其是miR-21和miR-126的组合在MPM诊断具有价值，其敏感度、特异度分别为86%、87%；该团队还分析了肺腺癌及MPM胸腔积液、组织标本miRNAs的表达差异，结果显示miR-130a、miR-141、miR-193a、miR-205、miR-375和miR-675表达均有差异，MPM中仅miR-130a出现明显高表达，诊断敏感度、特异度分别为77%、67%，说明通过MiRNAs可鉴别肺癌与MPM。上述研究证实通过MiRNAs可鉴别MPM与肺癌，MPM与其他非MPM胸膜病变，但检测miRNAs指标不尽相同，还需进一步研究。

3 MiRNAs对MPM的疗效评价及预后评估

研究证实MiRNAs可作为MPM疗效评价及预后评估的生物标记物［23］。MICOLUCC等［24］通过自定义MiRNA表达分析平台对44个训练集和98个MPM肿瘤样本进行分析，高水平的组织miR-29c证实术后具有较高生存时间，可作为评估肿瘤进展的独立预后指标。KINOSHITA等［25］使用qRT-PCR检测了25例MPM患者组织样本和20例反应性间皮细胞增殖（RMPs）患者组织中miR-31的表达，结果显示与RMPs相比，MPM中miR-31表达降低。然而miR-31的上调与肉瘤样成分的存在有关，且受这种组织学肿瘤亚型影响的患者预后较差。miR-17-5p和miR-30c的低组织水平与肉瘤样MPM患者更好的OS相关。miR-30c在3种MPM组织型中均有差异表达。说明MiRNAs的表达在肿瘤分型中也具有一定价值。NICOLÈ等［26］研究发现miR-205的组织水平在更具侵袭性的混合型和肉瘤型MPM组织类型中较低，而在预后较好的上皮样组织中较高，提示miR-31、miR-17-5p、miR-30c和miR-205在MPM组织病理学鉴别中具有价值，与KINOSHITA等［25］的研究结果类似。KAO等［27］研究发现6-miR评分可预测行胸膜外全肺切除术的MPM患者生存率，包括miR-21-5p、miR-23a-3p、miR-30e-5p、miR-221-3p、miR-222-3p、miR-31-5p，并首次将6-miR评分修改为2-miR评分用于诊断未进行化疗的患者，将2-miR评分与临床评分联合预测预后更有价值。类似的研究中DE SANTI等［28］通过分析52例MPM组织标本发 现 了2个miRNA的 预后特征，miR-let-7c-5p和miR-151a-5p的高水平表达与较低的总生存期相关。TRUINI等［29］使用微阵列平台分析了未经切除的MPM患者，共获得27例组织样本，对其进行完整的MiRNA分析后，认为miR-99a、miR-let-7c和miR-125b可作为潜在的预后因子。72例已知总生存期的MPM患者进行MiRNA测序测试，并在30名MPM患者的独立组中通过RT-qPCR进行验证，发现miR-99a、miR-let-7、miR-125b MiRNA簇下调能够预测未切除MPM的不良预后。ANDERSEN等［30］通过对5例术前诊断为MPM的活检标本、5例非肿瘤间皮标本、5例化疗后的MPM标本共计742个MiRNAs进行检测进行分析，发现MPM样品中miR-126、miR-143、miR-145和miR-652的表达水平显著低于非肿瘤胸膜组织，术前与化疗后MiRNAs具有差异，表明对MPM的疗效评价均具有价值。上述研究表现MiRNAs对MPM疗效评价及预后评估具有重要价值，但采用的方法、指标不尽相同，部分样本量太小，尚需更多的研究证实。

4 小结与展望

综上所述，MiRNAs参与了MPM的发生发展、转移等过程，但具体作用机制未完全阐明。MiRNAs在MPM的筛查、诊断及鉴别诊断中具有重要价值，可鉴别胸膜良恶性病变、病理亚型，对MPM的疗效评价、生存预后评估也有一定价值。但由于Mi-RNAs标记物多样、验证方法不同、研究对象也不统一（血清、组织标本、胸腔积液），使得研究结果不能标准化，还需更多中心参与。未来随着对MiRNAs深入研究，可能阐明MiRNAs在MPM发生发展、转移等过程具体作用机制，为MPM的早期筛查、诊断、靶向治疗提供新的思路。