特发性肺纤维化患者血清lncRNA PCGEM1表达水平及意义分析

许玉妮 曹晓强 孙鸿高 陈 林 王朝英 林 翀

（海南医学院第二附属医院检验科，海口 570203）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种原因不明的致命性间质性肺炎，患者以慢性、进行性、不可逆转、高度异质性的肺实质损害和纤维化为主要临床特征，以弥漫性的肺泡炎、肺实质炎症、肺间质胶原过度沉积、纤维母细胞过度增生为主要病理特点。患者的临床常见症状为渐进性劳力性气急、干咳、双下肺吸气末捻发音、呼吸困难、低氧血症、乏力，晚期可因发生呼吸功能衰竭而死亡，CT扫描可见胸膜下、两肺基底部网格状阴影和蜂窝影，肺功能检查显示限制性通气和弥散功能障碍［1-3］。IPF多发于老年人群，在50岁以下人群中极少发病，男性发病率明显高于女性，IPF在全球范围内的发病率约为（3～6）/10万人，但有的地区可高达（13～20）/10万人，且呈现逐年上升的趋势。IPF具有进展迅速、致死率高、预后较差的特点，患者的中位生存期多为确诊后的2.5～3.5年，五年生存率仅为20%～40%［4］。IPF的发病机制目前尚未阐明，主要原因是肺部慢性炎症损伤所致肺纤维化，因此临床上一般应用糖皮质激素、免疫抑制剂或细胞毒制剂等进行抗炎治疗。随着临床研究的深入，研究者发现仅有20%的IPF患者对糖皮质激素治疗敏感，而且常常为过性反应，免疫抑制剂及细胞毒性药物不仅存在严重的副反应，而且对IPF治疗效果极小，临床上尚无对IPF有特效的治疗方案，加之IPF早期缺乏特异性临床表现，故诊断和治疗难度均较高［5-7］。近年来的研究结果显示，IPF的发病不仅与肺部的慢性炎症反应有关，而且还与免疫细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞和肺泡上皮细胞等相关细胞、多种细胞因子及相关生物信号通路的病理变化有关，IPF与肺癌一样，表观遗传学的改变和基因突变、非编码RNA的异常表达等机制均在其发生和进展中发挥着重要的作用［8］。微小RNA和lncRNA等非编码RNA在人类基因组中的占比高达75%以上，它们最开始被认为是不具有任何功能的基因噪声，但随着研究的深入，非编码RNA的重要作用逐渐被重视，lncRNA是指长度大于200个碱基的非编码RNA，它能够在转录、转录后、表观遗传等多个水平对相关基因的表达发挥调控作用，从而广泛参与基因组印迹、染色体重塑、转录激活、转录干扰等多种生物学过程并发挥重要的调控作用，具有多重的生物学效应。PCGEM1是一种特异性表达于前列腺的基因，位于染色体2q32位点，也是在前列腺癌中发现的第1个肿瘤相关lncRNA，近年来的研究结果显示，PCGEM1的减弱凋亡反应、促进细胞增殖的功能不仅与肿瘤的发生和进展密切相关，而且还与成纤维细胞功能亢进有关，故可能与IPF的发生也存在关联，但目前学术界尚未见针对lncRNA PCGEM1与IPF关系的专题性研究，基于这一研究现状，本研究对IPF患者血清lncRNA PCGEM1表达水平及意义进行了观察和分析。

1 资料与方法

1.1 资料 选取2018年3月至2019年3月收治的106例IPF患者作为病例组，纳入患者均符合中华医学会呼吸病学分会间质性肺疾病学组2016年制订的《特发性肺纤维化诊断和治疗中国专家共识》中的IPF诊断标准［9］，患者均存在限制性通气功能障碍、气体交接障碍等肺功能异常表现，均经查问病史及临床检查排除已知原因引起的间质性肺疾病，胸部影像学检查显示双肺出现网状改变、蜂窝肺，可伴有磨玻璃影，部分病例查体双肺可闻及吸气性啰音。患者的病程为3～20个月，平均病程为（8.56±4.48）个月。选取100名健康体检患者作为对照组，纳入研究对象均经临床检查排除心肺疾病、恶性肿瘤、脑卒中、肝肾功能不全，肺部影像学检查及肺功能检查均未见异常。两组研究对象均排除合并有急慢性感染者、入组前2个月内具有应用免疫抑制剂和皮质类固醇激素者、合并支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张等其他肺部疾病者。两组研究对象在性别、年龄方面、吸烟者比例、吸烟指数等方面的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。两组研究对象均对本研究知情并签署知情同意书，本研究方案经医院医学伦理委员会审核通过。

表1 特发性肺纤维化患者基础资料［（±s，例（%）］Tab.1 Basic data for patients with idiopathic pulmonary fibrosis［（±s，n（%）］

表1 特发性肺纤维化患者基础资料［（±s，例（%）］Tab.1 Basic data for patients with idiopathic pulmonary fibrosis［（±s，n（%）］

Groups Case Control t/χ2 P n 106 100 Gender（male/female）65/41 62/38 0.010 0.920 Age（years）65.51±8.06 66.13±7.92 0.556 0.438 Ratio of smoker 45（42.45）44（44.00）0.050 0.823 Smoking index（cigarette×year）100 2.23±22.36 100 9.56±31.71 1.263 0.092

1.2 观察指标和检测方法 采集两组研究对象的空腹外周静脉血样本，于室温下静置放置1 h后3 000 r/min离心10 min后分离血清，置于-80℃冰箱中保存待测，应用Trizol试剂提取总RNA，经DNA酶处理后应用ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录合成cDNA，置于-20℃冰箱中保存待测，应用实时定量荧光聚合酶链式反应（RT-qPCR法）对血清样本中的lncRNA PCGEM1相对表达量进行检查和比较，以GAPDH为内参，目标RNA的引物序列见表2，反应体系见表3。反应条件为95℃预变性5 min，95℃5 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共反应40个循环。读取待测lncRNA与内参的循环阈值（Ct值），并计算两者Ct值的差值（ΔCt值），以2-ΔΔCt法表示待测lncRNA的相对表达量。采集两组研究对象的动脉血样本，应用动脉血气分析仪（丹麦雷度公司生产）对动脉血氧分压（PaO2）、氧饱和度（SaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）进行检测和比较。应用肺功能检测仪（日本福田公司生产）对两组研究对象的用力肺活量（FCV）、第一秒用力呼气容积（FEV1）、一氧化碳弥散量占预计值的百分比（DLCO%）、肺总量（TLC）进行检测和比较。

表2 目标RNA的引物序列Tab.2 Sequences of primers of target RNAs

表3 RT-qPCR的反应体系构成Tab.3 Contents of reaction system of RT-qPCR

1.3 统计学分析 采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用±s表示，两组之间比较采用独立样本t检验进行处理，lncRNA PCGEM1诊断IPF的价值分析采用受试者工作特征曲线（ROC曲线）进行处理，以曲线下面积（AUC）衡量诊断价值，取Youden指数最大时为最佳筛选界值（Cut-off值），lncRNA PCGEM1与动脉血气指标、肺功能指标的相关性分析采用直线相关分析进行处理，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象血清lncRNA PCGEM1相对表达量、动脉血气指标、肺功能指标的比较 病例组患者的lncRNA PCGEM1相对表达量、动脉血气PaO2、SaO2、肺功能指标均低于对照组，动脉血PaCO2高于对照组，两组之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 血清lncRNA PCGEM1相对表达量、动脉血气指标、肺功能指标检测结果（±s）Tab.4 Relative expression of serum lncRNA PCGEM1，arterial blood gas indicators and pulmonary function indicators between subjects in two groups（±s）

表4 血清lncRNA PCGEM1相对表达量、动脉血气指标、肺功能指标检测结果（±s）Tab.4 Relative expression of serum lncRNA PCGEM1，arterial blood gas indicators and pulmonary function indicators between subjects in two groups（±s）

Groups Case Control tP n 106 100 lncRNA PCGEM1（2-ΔΔCt）52.76±28.87 99.27±47.12-8.481＜0.001 PaO2（mmHg）62.05±5.93 83.35±3.31-31.575＜0.001 SaO2（%）91.44±2.77 96.61±0.89-17.815＜0.001 PaCO2（mmHg）40.42±2.21 37.96±3.38 6.144 0.001 FVC（%）55.40±5.92 98.87±7.32-46.987＜0.001 FEV1（%）57.06±5.94 99.95±6.04-51.374＜0.001 DLCO（%）61.58±23.87 102.16±17.56-13.832＜0.001 TLC（%）72.87±19.67 99.67±5.16-13.201＜0.001

2.2 血清lncRNA PCGEM1相对表达量在诊断特发性肺纤维化的价值分析ROC曲线分析结果显示，血清lncRNA PCGEM1相对表达量诊断IPF的AUC为0.785，95%置信区间为0.719～0.852，Cut-off值为104.135，此时Youden指数为0.581，灵敏度为59%，特异度为99.1%，见图1。

图1 血清lncRNA PCGEM1相对表达量诊断IPF的ROC曲线Fig.1 ROC curve on of relative expression of serum lnc-RNA PCGEM1 in diagnosis of IPF

2.3 IPF患者血清lncRNA PCGEM1相对表达量与动脉血气指标和肺功能指标的相关性 直线相关研究结果显示，IPF患者的血清lncRNA PCGEM1相对表达量与动脉血PaO、FVC、FEV1、DLCO%、TLC均呈正相关（P＜0.05），与动脉血PaCO2呈负相关关系（P＜0.05）。见表5、图2。

表5 IPF患者血清lncRNA PCGEM1相对表达量与动脉血气指标和肺功能指标的直线相关分析Tab.5 Linear correlation analysis on relative expression of serum lncRNA PCGEM1 and arterial blood gas indicators，pulmonary function indicators

图2 IPF患者血清lncRNA PCGEM1相对表达量与动脉血气指标和肺功能指标的相关性Fig.2 Correlation among relative expression of serum lnc-RNA PCGEM1 and arterial blood gas indicators，pulmonary function indicators

3 讨论

本研究结果显示，IPF患者表现为血清lncRNA PCGEM1相对表达水平降低，而且在相对表达量为104.135时，血清lncRNA PCGEM1诊断IPF的价值最大，这一阳性筛选界值虽然未获得较高的敏感度，但特异度较高，这说明lncRNA PCGEM1的低表达可能参与了IPF的病理过程，血清lncRNA PCGEM1水平可作为辅助诊断IPF的指标。PCGEM1是一种与前列腺癌关系密切的lncRNA，学术界对其进行的研究也是从针对前列腺癌的研究开发的，在近年来的研究中，大多数研究者仍然是围绕PCGEM1与前列腺癌及雄激素受体（AR）开展相关研究。朱竹先等［10］的研究结果显示，依赖AR的前列腺癌细胞呈现出显著的PCGEM1高表达，前列腺癌组织中PCGEM1的表达与AR的表达水平具有显著的相关性。转移性肿瘤中的PCGEM1细胞核内定位与良性前列腺肿瘤存在着显著的差异，PCGEM1与AR之间存在一定程度的共定位现象。ZHANG等［11］研究结果显示，PCGEM1与剪接因子核内不均一核糖核蛋白（hnRNP A1和U2AF65）相互作用，诱导PCGEM1表达能够调节hnRNP A1和U2AF65与AR mRNA前体之间的竞争，因此AR的表达与PCGEM1及其剪接因子的作用具有相关性。HE等［12］研究发现，PCGEM1可与miR-145产生互相调控作用，从而促进前列腺癌细胞的增殖，过表达的miR-145能够下调PCGEM1的表达水平，而PCGEM1能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭并在体外诱导转染细胞的凋亡。PAROLIA等［13］的研究结果显示，PCGEM1能够作为体内雄激素调节的潜在核和/或胞质功能的转录本，从而调节AR的活性，影响前列腺癌的病程转归。但PRENSNER等［14］的研究中PCGEM1并不能影响前列腺癌患者的预后情况。关于调控PCGEM1表达水平的机制，HO等［15］的研究结果显示，p54/nrb信号通路能够调节PCGEM1和AR的表达，从而影响前列腺癌的进程。HIRSCH等［16］的研究结果显示，γ-谷维素能够通过调控PCGEM1在DU145和LNCaP细胞中的基因表达水平影响前列腺癌细胞的增殖和凋亡周期，从而在前列腺癌的治疗中发挥辅助作用。XUE等［17］的研究结果还显示，PCGEM1的基因多态性也可用于辅助评价中国人群前列腺癌发病风险的指标。此外，徐岷等［18］的研究结果显示，胰腺癌组织中PCGEM1水平也要高于癌旁组织，过表达的PCGEM1可增强肿瘤细胞的增殖和迁移能力，增加肿瘤组织的MMP2和MMP9表达水平，降低E-钙黏着蛋白水平。总之，学术界一般认为，PCGEM1是一种抑制肿瘤细胞凋亡的lncRNA，其表达水平的增加有利于肿瘤的增殖和转移，但该领域的研究焦点比较集中，针对PCGEM1在非肿瘤疾病的研究成果比较缺乏，但却为进一步的研究开辟了广阔的前景，本研究中选取了PCGEM1作为研究指标也是基于PCGEM1在细胞周期中生物学作用的研究成果，但不同的是本研究结果提示了在IPF这种纤维化性疾病中出现了PCGEM1低表达的现象，这可能是由于PCGEM1低表达增进了正常肺组织细胞的凋亡，导致慢性损伤的肺组织无法得到有效的修复，而同时又促进了成纤维细胞等肺间质细胞的增殖，从而引起肺组织的纤维化。

本研究结果显示，IPF患者的血清lncRNA PCGEM1相对表达量与动脉血气指标和肺功能指标均具有相关性，这提示了PCGEM1相对表达量的降低可能参与了IPF的病理进展过程。在近年来针对PCGEM1在非肿瘤组织中表达水平的研究中，KANG等［19］发现在骨关节炎滑膜细胞中也存在着PCGEM1的过表达，PCGEM1能够通过影响miR-770前驱体的转染来诱导滑膜细胞凋亡，外源性增加PCGEM1的表达能够抑制细胞的凋亡、诱导自噬、刺激滑膜细胞的增殖。而李博文等［20］通过针对17种lnc-RNA进行筛查研究发现，PCGEM1在哮喘患者的血清中呈现出了明显的低表达，检测其血清水平能够用于哮喘的临床诊断。这两项研究提示了PCGEM1在不同类型的炎症反应性疾病中可能存在着差异性的表达，而在IPF等肺部慢性炎症疾病中，PCGEM1的低表达可能发挥了促进肺实质与肺间质增生平衡破坏和恶化的作用，但其确切机制尚有待于进一步的基础研究并予以讨论和证实。

综上所述，IPF患者表现为血清lncRNA PCGEM1相对表达量的显著降低，而且其水平与患者的动脉血气指标和肺功能指标具有相关性，提示了lnc-RNA PCGEM1的低表达可能参与了IPF的发生和进展过程，其水平可作为IPF辅助诊断的指标。