US31介导人巨细胞病毒调控系统性红斑狼疮发生的机制研究①

刘春雅 金 晶 李玉芳 喻 敏 姜 毅 徐利鸳（衢州市人民医院肾内科，衢州 324000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种典型的自身免疫性疾病，在育龄女性中的发病率逐年升高，严重影响人们的正常生活，SLE患者病情呈现稳定和活动交替的状态，尚无根治方法，且存在一定程度的致残率和病死率［1］。体内凋亡过程受损、先天和适应性免疫系统过度激活、补体激活、免疫复合物和组织炎症的复杂相互作用最终导致自我维持的自身免疫性过程［2］。但迄今为止SLE的病因和发病机制尚未完全阐明。因此，探索SLE的发病机制，可为SLE防治提供新的思路和策略，是近年的研究热点。

SLE是一种复杂的疾病，采用免疫抑制的治疗方式是该疾病的首选治疗方案［3］。细胞介导免疫是控制疱疹病毒感染的重要举措，IFN-γ也被认为在此过程中发挥关键作用［4］。事实上，由于这种免疫抑制，SLE患者感染风险增加，严重影响其预后［5］。在不同的病原体中，病毒感染效率不同，如人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）和EB病毒（EBV）与SLE的发生密切相关，这些病毒属于疱疹病毒科，可使病程复杂化［6-7］。除外中性粒细胞和淋巴细胞，HCMV几乎可感染内、中、外胚层起源的所有细胞［8］。随着研究的深入，许多证据均提示，人群普遍感染的HCMV可能是SLE的一个重要病因，并加重SLE疾病的进程［9］。但HCMV调控SLE发生的具体机制尚未阐明。此外，HCMV和EBV均可引起疾病暴发，并已在SLE的致病过程中得到证实［10］。有研究认为EBV可通过核抗原与自身抗原交叉反应的分子结合诱导SLE，而HCMV可通过分子模拟、表位扩散和抗原结合诱导免疫反应引起自身免疫［11-12］。在这种情况下，免疫系统抵抗病毒感染的作用至关重要。

本研究旨在探索HCMV调控SLE发生的具体机制，为阐明SLE的发生机理奠定基础，同时也为SLE的有效治疗提供一定的临床应用方向。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 样本来自温州医科大学的60例SLE患者和111例健康志愿者，受试者均知情同意；THP1单核细胞、THP1源性的巨噬细胞均购自温州医科大学基础实验室。

1.1.2 主要试剂与仪器 抗体滴度检测试剂盒（蓝波生物公司）；PAXgene Blood RNA Kit（君诺德生物公司）；RNA反转录试剂盒（Thermo Fisher）；TB Green（TaKaRa）；US31过表达质粒（捷瑞生物）；重组腺病毒包装体系质粒（中科院上海生化所）；Lipofectamine®2000（Sigma）；p100、US31、NF-κB2 p52、ReIB、GAPDH蛋白（Abclonal）；蛋白核质分离试剂盒（天根生物）；MG132蛋白酶抑制剂（碧云天生物）；PEI、PEG8000（生工）；引物合成（华大基因）。

1.2 方法

1.2.1 血清抗-HCMV IgG与IgM抗体滴度检测

采用金标免疫斑点法进行抗体滴度检测，先将待测血清用缓冲液稀释为1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320等不同的梯度，然后按照抗体滴度检测试剂盒内说明书操作。

1.2.2 外周血白细胞HCMV检测阳性率 梯度离心法分离外周血中的白细胞，试剂盒提取外周血白细胞中的总RNA，巢式PCR检测外周血白细胞中HCMV UL55基因表达，如若UL55基因有表达即视为阳性，UL55基因没有表达即视为阴性。引物序列见表1。

表1 巢式PCR引物序列Tab.1 Nested PCR primer sequences

1.2.3 RT-PCR检测SLE患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中HCMV病毒基因表达 梯度离心法分离SLE患者外周血中的白细胞，试剂盒提取外周血中的总RNA，将RNA反转录成cDNA，PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳筛选相对特异性高表达的病毒基因。筛选得到的11个在SLE患者中相对特异性高表达的病毒基因，引物序列见表2。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测SLE患者PBMC中US31表达水平 梯度离心法分离SLE患者外周血中的白细胞，试剂盒提取外周血中的总RNA，将RNA反转录成cDNA进行实时荧光定量PCR，实验分析 采用相对定量 法，运用2-ΔΔCt计 算UL31表达。UL31引物序列见表2。

表2 PCR引物序列Tab.2 PCR primer sequences

1.2.5 构建过表达US31蛋白的重组腺病毒（AdUS31） 选用10μg AAV、Helper、AAV shuttle vector质粒的腺病毒包装体系，加入100μl PEI转染293T工具细胞。60 h后收集病毒上清，低温离心后，上清用PEG8000（40%）浓缩，残留的细胞采用反复冻融裂解，将浓缩的上清和冻融的细胞悬液混匀，添加1 mmol/L MgCl2和25 U/ml Benzonase混匀后，37℃静置1 h，低温离心后，取上清。利用17%、25%、40%、60%浓度梯度的碘克沙醇浓缩纯化病毒。使用qPCR方法进行病毒滴度测定。

1.2.6 重组腺病毒（AdUS31）感染THP1单核细胞或THP1源性的巨噬细胞 待THP1单核细胞或THP1源性的巨噬细胞生长至70%密度时开始感染病毒，病毒感染滴度为1×1011GC/ml，病毒感染72 h结束实验。

1.2.7 免疫共沉淀（Co-IP）检测NF-κB2与US31的相互作用 收集3×106个细胞加入裂解液并反复冻融使细胞充分裂解，离心取上清后，每1×107个细胞加入2.5μl抗体（IgG作为阴参）4℃孵育过夜，第2天加入20μl Protein A+G bead Agarose 4℃孵育2 h，离心去除上清，加入wash buffer反复清洗Protein A+G bead Agarose，最终EP管中留20μl样本，加入loading buffer，煮沸，吸取上清，进行免疫印迹实验。

1.2.8 细胞水平转染si-NF-κB2待细胞生长至80%覆盖面积时换无血清培养基饥饿处理6 h以便siRNA可以更好地进入细胞内，参照说明书步骤操作，先将siRNA（对照组为NC）储液、Lipofectamine®2000和培养基室温预混20 min后，配制成所需的工作液。弃去原饥饿培养基，将混合液加入培养板中，轻轻混匀。将培养板放入37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。8 h后换成无血清培养基，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中继续培养48 h至实验结束。siRNA si-NF-κB2正义链序列：5'-GAACAGCCTTGCATCTAGCC-3'，反义链序列：5'-CAGAGTCCGAGTCGCTATCA-3'。

1.2.9 RT-qPCR检测单核巨噬细胞过表达US31抑制NF-κB2后炎症相关基因表达 重组腺病毒（AdUS31）感染单核巨噬细胞24 h后，转染siRNA抑制NF-κB2表达，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中继续培养至72 h实验结束。Trizol法提取细胞中的总RNA，并反转录为cDNA进行RT-qPCR，引物序列见表3。

表3 qPCR引物序列Tab.3 qPCR primer sequences

1.2.1 0蛋白免疫印迹实验 在细胞培养板中加入Western裂解液将细胞充分裂解，离心取上清弃沉淀，用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度并调整各组浓度统一，蛋白加入5×Loading buffer（含β-巯基乙醇）热煮变性，配制SDS-PAGE凝胶，蛋白电泳结束后将蛋白转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。加入稀释后的一抗：P-p100（Abclonal，1∶1 000）、p100（Abclonal，1∶1 000）、US31（Abcam，1∶1 000）、P52（Abclonal，1∶1 000）、Re1B（Abclonal，1∶1 000）、Ub（Abcam，1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000），于4℃摇床孵育过夜。次日置于HRP标记的山羊抗兔二抗（Jackson，1∶10 000）室温孵育2 h，ECL发光试剂盒显影，Image J分析蛋白条带的灰度值进行统计分析。

1.3 统计学分析 使用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析。数据记录为±s。通过单因素方差分析及独立样本t检验确定组间统计学显著性。P＜0.05定义为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCMV感染与SLE相关

2.1.1 SLE患者抗-HCMV抗体水平明显高于健康志愿者SLE患者的抗HCMV-IgG（图1A）及IgM（图1B）抗体滴度均明显高于对照组（P＜0.05）。

图1 SLE患者与健康志愿者血清抗-HCMV IgG与IgM抗体滴度比较Fig.1 Comparison of serum anti-HCMV IgG and IgM antibody titers between SLE patients and healthy volunteers

2.1.2 SLE患者外周血白细胞HCMV检测阳性率明显高于健康志愿者 巢式PCR结果显示，SLE患者外周血中HCMV检出率明显高于对照组（P＜0.001），其阳性率分别为41.7%和1.80%。见表4。

表4 SLE患者与健康志愿者HCMV阳性率比较表Tab.4 Comparison of HCMV positive rates between SLE patients and healthy volunteers

2.2 US31是SLE相关的HCMV病毒基因 采用全转录组测序和mRNA测序聚类分析后共鉴定出11个在SLE患者中相对特异性高表达的病毒基因：UL32、UL36、UL44、UL50、UL56、UL82、UL84、UL95、UL105、UL117及US31（图2）。在11个SLE患者相对特异性高表达的HCMV病毒基因中，进一步通过RT-PCR实验发现，SLE患者PBMC中US31表达水平明显高于健康志愿者（图3）。

图2 SLE患者PBMC中HCMV病毒基因表达谱的检测Fig.2 Detection of HCMV virus gene expression profiles in PBMC of SLE patients

图3 US31是SLE患者PBMC特异高表达的HCMV基因Fig.3 US31 is HCMV gene specifically and highly expressed in PBMC of SLE patients

2.3 US31过表达促进M1型巨噬细胞炎症反应构建过表达US31的重组腺病毒（AdUS31），感染THP1单核细胞和THP1源性的巨噬细胞，通过转录组测序及RT-PCR分析US31基因对单核-巨噬细胞功能的影响。结果显示，与对照组（感染AdGFP腺病毒）相比，THP1单核细胞和THP1源性的巨噬细胞感染AdUS31后分别有133和92个基因的表达发生改变（图4A、B），进一步分析发现16个在US31过表达后上调的M1型相关基因（图4C）。

图4 US31基因表达促进M1型巨噬细胞功能和表型Fig.4 US31 gene expression promotes the function and phenotype of M1 macrophages

2.4 US31与NF-κB2相互作用促进NF-κB2通路活化 将US31抗体和NF-κB2抗体进行免疫共沉淀（Co-IP）实验，筛选与US31相互作用的蛋白，结果发现p100和p52均可与US31相互作用（图5A、B）。

细胞水平感染过表达US31蛋白的重组腺病毒，免疫印迹实验发现US31表达量升高，说明细胞水平感染实验成功，并且过表达US31蛋白的重组腺病毒有效，利用siRNA抑制NF-κB2表达时，通过免疫印迹实验发现，US31表达没有变化，但磷酸化的前体p100水解成的激活状态p52表达水平降低，RelB表达量降低。荧光定量PCR结果表明，细胞在感染过表达US31蛋白的重组腺病毒后，炎症相关基因TNF-α、IL-8、CCL2、ICAM1表达量明显升高，但共转染NF-κB2的siRNA后，炎症相关基因表达明显降低，说明NF-κB2是US31促进单核巨噬细胞炎症反应的相互作用蛋白（图5C）。

细胞水平感染过表达US31蛋白的重组腺病毒后，分离细胞核和细胞质中的蛋白质，免疫印迹实验发现，US31蛋白主要表达于细胞质，并且在感染过表达US31蛋白的重组腺病毒后，US31蛋白表达明显升高，p100表达量降低（图5D）。

图5 US31与NF-κB2相互作用促进NF-κB2通路活化Fig.5 US31 interacts with NF-κB2 to promote activation of NF-κB2 pathway

细胞水平感染过表达US31蛋白的重组腺病毒时同时添加MG132蛋白酶抑制剂，免疫印迹实验发现，相较于未添加抑制剂组，添加抑制剂组的US31表达降低，磷酸化p100表达量升高（图5E）。US31表达促进磷酸化的p100泛素化（图5F）。

3 讨论

既往研究发现，HCMV诱导单核细胞死亡，促进炎症反应，诱导细胞周期阻滞，影响SLE的发生和发展［13］。此外，对感染的单核细胞转录组测序表明，HCMV参与重编程单核细胞向M1巨噬细胞分化［14］。然而，目前关于SLE患者PBMC中HCMV基因表达的研究尚不明确。采用全转录组测序和mRNA测序聚类分析SLE患者PBMC中HCMV病毒基因表达谱，更加全面可靠地找出差异基因，共鉴定出11个在SLE患者中相对特异性高表达的病毒基因。

本研究发现，鉴定出的11个在SLE患者中相对特异性高表达的病毒基因都已被证明与HCMV潜伏有关［15］。例如，UL32是一种主要的被膜蛋白，参与病毒的组装、成熟和释放、基因的表达和调节以及宿主细胞周期的修饰和蛋白质的合成，并且与HCMV潜伏期过程延长有关［16］。另外，UL36参与细胞凋亡、基因表达调控和编码有毒蛋白过程，UL44、UL50、UL56、UL82、UL84、UL95、UL105和UL117也与病毒潜伏过程有关［16-23］。因此，HCMV在SLE患者PBMC中处于潜伏感染状态。

研究者使用HCMV潜伏感染CD34+细胞的体外模型，随后使用HCMV cDNA的微阵列模型发现68个与HCMV生产性感染不同的基因［16］。同样，也有研究者使用基因阵列来评估潜伏的HCMV感染的骨髓细胞中的病毒基因表达，观察到37个差异表达的基因［24］。最后，对实验和自然HCMV CD14+单核细胞和CD34+细胞感染的HCMV基因转录本进行高通量测序分析，共检测到20个基因发生变化［19］。与既往研究者发现的差异基因相比，本研究中只发现11个差异表达的基因，这种研究结果的差异可能是由于检测方法、研究对象和实验性及自然HCMV感染模式的不同。此外，本研究结果表明US31是一种与SLE疾病相关的基因，在既往研究中没有涉及。

然而，本研究分析的US31基因目前还没有被报道过功能，由于先前有报道称HCMV增殖相关的IE2 86基因可通过抑制US31基因的表达抑制HCMV细胞的增殖，因此猜测US31可能是HCMV增殖期相关的基因［25］。由于US31表达量不高，大众的关注度也不高，既往研究基本未涉及US31的报道［16，24］。但本研究数据表明，与健康对照组相比，SLE患者的US31基因表达阳性率确实更高，并已通过qPCR得到证实。表明US31表达与SLE的发生密切相关。

有研究报道US31在HCMV感染的单核细胞来源的DCs、M1和M2细胞中高表达［26］。为了探讨US31在单巨噬细胞中的功能，本研究使用编码US31蛋白的重组腺病毒感染THP-1细胞和THP-1来源的巨噬细胞后进行转录组测序，随后的生物信息学分析显示，US31主要参与炎症反应和M1巨噬细胞表型形成过程。结合Co-IP实验和小干扰RNA沉默实验，确定了NF-κB2与US31直接相互作用调控单巨噬细胞的免疫功能。

NF-κB调节的关键基因参与细胞的增殖、凋亡及炎症反应过程［27］。非经典的NF-κB信号通路通过磷酸化p100的多聚泛素化和蛋白酶体激活RelB/p52 NF-κB复合体［28］。本研究发现US31过表达不仅促进了p100向p52的转化和RelB/p52复合物向细胞核的移位，还上调了RelB和p100的表达，当US31过表达时，磷酸化和泛素化的p100在蛋白酶体抑制剂MG132存在的情况下表达量升高，在转染NF-κB2的siRNA后，炎症相关因子TNF-α、IL-8、CCL2、ICAM1表达降低。这些结果表明，HCMV诱导US31的表达可能通过与NF-κB2通路相互联系直接改变炎症相关疾病基因的表达。

综上所述，本研究首次对SLE患者外周血中HCMV基因的表达进行了系统全面的研究，发现US31表达可改变单核巨噬细胞的免疫功能，促进M1炎症反应。这一机制的阐明为SLE新的治疗方案的开发提供了有价值的见解，最终的目标是治疗和预防这种流行的自身免疫性疾病的发展。