miR-223对呼吸衰竭患者Th1/Th2细胞功能及免疫功能的影响①

万程伟 李 银 朱赞雷 许 硕 邱日皇 黎燕群 周建英 郭猷殚

（江西省赣州市人民医院，赣州 341000）

近年来呼吸衰竭患者频频增加，以肺内外各种原因引起的通气和换气功能严重障碍为其产生原因［1-2］。呼吸衰竭以呼吸困难、精神症状、循环症状和器官障碍等为主要临床表现［3］。呼吸衰竭的病因主要由直接性肺损伤和间接性肺损伤构成［4］。Th1/Th2细胞中，Th1细胞主要负责细胞免疫，而Th2细胞主要负责体液免疫［5-6］。miR-223以其在各种肿瘤及癌症细胞中均存在异常表达等特点已然成为现代医学研究的新方向和新思路，目前关于miR-223的报道主要集中在胃癌、结肠癌和内皮细胞等方面，而对于miR-223表达对呼吸衰竭患者Th1/Th2细胞功能及免疫功能的影响缺乏相关讨论和报道［7-9］。本研究分析miR-223对呼吸衰竭患者Th1/Th2细胞功能及免疫功能的影响，以期为呼吸衰竭患者的临床治疗和生物靶标的选择方面提供更多参考资料。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取2017年3月至2018年12月于江西省赣州市人民医院收治的40例呼吸衰竭患者为呼吸衰竭（Respiratory failure）组（Ref）组，同期健康体检者40例为Con组。Ref组和Con组的基本概况如表1所示。纳入标准：符合呼吸衰竭的诊断标准，动脉血氧分压（PaO2）＜8 kPa或动脉血二氧化碳分压（PaCO2）＞6.65 kPa。排除标准：①合并其他多种种类恶性肿瘤者；②免疫缺陷及自身免疫性疾病患者［10］。

表1 Ref组和Con组的基本概况（±s）Tab.1 Basic overview of Ref and Con groups（±s）

表1 Ref组和Con组的基本概况（±s）Tab.1 Basic overview of Ref and Con groups（±s）

Project Age（years）Gender Male Female Type of disease（case）TypeⅠTypeⅡCourse of disease（year）Ref group（n=40）63.21±5.32 27 13 10 30 6.32±2.14 Con group（n=40）63.38±5.44 26 14 t/χ2 0.45＞0.05 0.62＞0.05 P

1.1.2 主要仪器和试剂 快速总RNA提取试剂盒（Sigma，RNB100-50RXN）、NanoDrop 2000仪器（Thermo Scientific）、PrimeScript RT试剂盒（Takara Bio，RR047A）、Human IL-2 ELISA Kit（碧云天公司，PI580）、Human TNF alpha ELISA Kit（Abcam，ab181421）、Human IL-6 ELISA Kit（碧云天公司，PI330）、Human IL-4 ELISA Kit（碧云天公司，PI618）、Human IFN gamma ELISA Kit（Abcam，ab46025）、Human IL-10 ELISA Kit（碧云天公司，PI528）、Human IgA ELISA Kit（Thermo，88-50600-22）、Human IgM ELISA Kit（Thermo，BMS2091）、Human IgG ELISA Kit（Thermo，BMS2098）、PRISM 7900序列检测系统（Applied Biosystems）、高通量测序仪（Life Technologies）、流式细胞仪（Sysmex Partec）。

1.2 方法 采用荧光定量PCR实验测定miR-223的mRNA表达，以U6作为内参，miR-223的引物设计如表2所示。采用PBMC法分离外周血单个核细胞，采用电穿孔顺式转染法将miR-223和对照组质粒转入核细胞［11］。采用ELISA法测定miR-223对免疫功能的影响。采用流式细胞术测定miR-223对Th1/Th2细胞的影响。采用ELISA法测定miR-223对Th1/Th2细胞因子的影响。

表2 miR-223引物设计Tab.2 Primer design of miR-223

1.3 统计学方法 采用t检验实现两组间比较，采用方差检验实现多组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义，数据均用SPSS22.0进行软件统计分析。

2 结果

2.1 miR-223 mRNA表达水平 由图1可知，外周血中Ref组的miR-223 mRNA表达水平为（2.23±0.32），Con组的miR-223 mRNA表达水平为（1.06±0.26）（t=13.634，P＜0.01），故外周血Ref组的miR-223 mRNA表达水平相较Con组极显著上调（P＜0.01）。细胞中Ref组的miR-223 mRNA表达水平为（1.73±0.24），Con组的miR-223 miRNA表达水平为（0.89±0.14）（t=11.224，P＜0.01），故细胞中Ref组的miR-223 mRNA表达水平相较Con组极显著上调（P＜0.01）。

图1 miR-223的mRNA表达水平Fig.1 Primer design of miR-223

2.2 miR-223对免疫球蛋白水平的影响 由图2可知，Ref组的IgA水平为（1.54±0.15），Con组的IgA水平为（2.53±0.26）（t=8.112，P＜0.01），故Ref组的IgA水平相较Con组极显著下调（P＜0.01）；Ref组的IgM水 平 为（8.87±0.91），Con组 的IgM水 平 为（14.29±1.43）（t=8.567，P＜0.01），故Ref组的IgM水平相较Con组极显著下调（P＜0.01）；Ref组的IgG水平为（1.03±0.09），Con组的IgG水平为（2.08±0.22）（t=8.251，P＜0.01），故Ref组的IgG水平相较Con组极显著下调（P＜0.01）。

图2 miR-223对免疫球蛋白水平的影响Fig.2 Effect of miR-223 on immunoglobulin level

2.3 miR-223对Th1/Th2细胞的影响 由图3和图4可知，Ref组的Th1细胞水平为（24.14±2.33），Con组的Th1细胞水平为（36.61±3.26）（t=9.535，P＜0.01），故Ref组的Th1细胞水平相较Con组极显著下调（P＜0.01）；Ref组的Th2细胞水平为（29.24±2.91），Con组的Th2细胞水平为（36.59±3.63）（t=9.251，P＜0.01），故Ref组的Th2细胞水平相较Con组极显著下调（P＜0.01）。

图3 miR-223对Th1细胞的影响Fig.3 Effect of miR-223 on Th1 cells

图4 miR-223对Th2细胞的影响Fig.4 Effect of miR-223 on Th2 cells

2.4 miR-223对Th1/Th2细胞因子的影响 由图5可知，Ref组的Th1类细胞因子IL-2水平为（6.23±0.46），Con组的IL-2水平为（4.24±0.26）（t=3.126，P＜0.05），故Ref组的IL-2水平相较Con组显著上调（P＜0.05）；Ref组的Th1类细胞因子IFN-γ水平为（106.27±9.91），Con组的IFN-γ水平为（80.29±6.43）（t=3.558，P＜0.05），故Ref组的IFN-γ水平相较Con组显著上调（P＜0.05）；Ref组的Th1类细胞因子TNF-α水平为（1.63±0.25），Con组的TNF-α水平为（0.83±0.12）（t=3.082，P＜0.05），故Ref组的TNF-α水平相较Con组显著上调（P＜0.05）。

图5 miR-223对Th1类细胞因子的影响Fig.5 Effect of miR-223 on Th1 cytokines

由图6可知，Ref组的Th2类细胞因子IL-6水平为（67.68±9.57），Con组 的IL-6水 平 为（13.82±2.46）（t=13.286，P＜0.01），故Ref组的IL-6水平相较Con组极显著上调（P＜0.01）；Ref组的Th2类细胞因子IL-10水平为（8.43±2.91），Con组的IL-10水平为（4.29±1.43）（t=3.466，P＜0.05），故Ref组的IL-10水平相较Con组显著上调（P＜0.05）；Ref组的Th2类细胞因子IL-4水平为（56.63±8.25），Con组的IL-4水平为（36.83±6.12）（t=3.951，P＜0.05），故Ref组的IL-4水平相较Con组显著上调（P＜0.05）。

图6 miR-223对Th2类细胞因子的影响Fig.6 Effect of miR-223 on Th2 cytokines

3 讨论

本研究以呼吸衰竭患者和健康体检者作为考察对象，研究了miR-223对呼吸衰竭患者Th1/Th2细胞功能及免疫功能的影响。采用荧光定量PCR实验测定miR-223的mRNA表达，结果发现外周血Ref组的miR-223 mRNA表达水平相较Con组极显著上调（P＜0.01）；细胞中Ref组的miR-223 mRNA表达水平相较Con组极显著上调（P＜0.01）。采用PBMC法分离外周血单个核细胞，采用电穿孔顺式转染法将miR-223和对照组质粒转入核细胞。采用ELISA法测定miR-223对免疫功能的影响，结果发现Ref组的IgA水平相较Con组极显著下调（P＜0.01）；Ref组的IgM水平相较Con组极显著下调（P＜0.01）；Ref组的IgG水平相较Con组极显著下调（P＜0.01），说明miR-223可下调免疫球蛋白水平。采用流式细胞术测定miR-223对Th1/Th2细胞的影响，结果发现Ref组的Th1细胞水平相较Con组极显著下调（P＜0.01）；Ref组的Th2细胞水平相较Con组极显著下调（P＜0.01），说明miR-223可以下调Th1/Th2细胞水平。采用ELISA法测定miR-223对Th1/Th2细胞因子的影响，结果发现Th1类细胞因子中Ref组的IL-2水平相较Con组显著上调（P＜0.05）；Ref组的IFN-γ水平相较Con组显著上调（P＜0.05）；Ref组的TNF-α水平相较Con组显著上调（P＜0.05）。Th2类细胞因子中Ref组的IL-6水平相较Con组极显著上调（P＜0.01）；Ref组的IL-10水平相较Con组显著上调（P＜0.05）；Ref组的IL-4平相较Con组显著上调（P＜0.05），说明miR-223可以上调Th1/Th2细胞因子水平。

在某些国内外的研究中，表明伴COPD呼吸衰竭患者的免疫功能降低，且随着病情的加重，其受损越明显，而这种免疫损伤则又会加重患者气道阻塞的程度和肺功能损伤［12］。有中医研究，伴COPDⅡ型呼吸衰竭的患者无论是缓解期还是急性发作期，其体内免疫功能紊乱严重，认为其发生机制也与机体的过度炎症应激有关［13-14］。有研究显示多种炎症因子与免疫细胞都与COPD伴呼吸衰竭有关，表明进一步改善患者的T细胞和免疫因子水平，可提高患者细胞免疫功能，进而利于病情的恢复［13］。且更有研究指出通过某些改善免疫功能的药物进行治疗，患者的肺功能、氧功能和T细胞免疫功能的临床疗效极好，且安全性高［15］。呼吸衰竭以其对循环和代谢的阻滞对胃肠道功能也会产生影响［16］。SWAYNE等［17］研究体外膜肺氧合（ECMO）的利用率发现，ECMO的使用和接受ECMO治疗的呼吸衰竭患者的老年、使用皮质类固醇、连续性肾脏替代治疗、驾驶压力和ECMO持续时间延长与死亡率增加有关。相关研究发现，减少PaCO2的高强度无创通气可改善健康相关质量生命、降低高碳酸血症慢性阻塞性肺病、高碳酸血症患者的恶化频率和死亡率［18］。通过减少高碳酸血症，还可以改善CO2诱导的免疫抑制并改善抗菌和抗病毒宿主防御。EVERED等［19］研究发现术后呼吸衰竭（PRF）是肝移植术后严重的肺部并发症（LTx）。在预测PRF的层次多因素模型的顶部，存在与天然肝脏、新肝脏、肺部表现相关的因素。移植前供体依赖因子、肾脏、心脏和大脑对早期呼吸恢复和LTx患者的ICU状态没有影响。具有高MELD和/或限制性呼吸模式和/或门静脉血栓形成的患者预后不良，最终可能因早期同种异体移植物功能障碍而恶化。UTAMI等［20］研究发现破伤风最常见的死亡原因是导致呼吸衰竭的气道问题，及时插管并给予呼吸机支持以及阿米卡星抗生素注射液有助于康复。WANG等［21］研究新生儿低氧呼吸衰竭（NRF）发现，与NRF＜50例/年的新生儿重症监护病房相比，新生儿重症监护病房发病率，NRF/新生儿重症监护病房入院率和呼吸机使用量增加数倍，死亡率降低。NRF死亡率与每个类别中极低出生体重患者的比例无关。新生儿重症监护病房的新生儿入院量较小，呼吸机使用量减少，SNAPPE-Ⅱ评估的死亡风险较高。SHINICHIRO等［22］研究体外膜肺氧合（ECMO）发现，流感相关急性呼吸衰竭的发生率、严重程度、特征和预后与呼吸机以及ECMO设置相关。控制台、回路、充氧器、离心泵和插管的类型发生的显著变化导致使用ECMO是流感相关急性呼吸衰竭患者总体生存率更高的独立预测因子。

综上所述，miR-223可以下调呼吸衰竭患者的免疫球蛋白水平和Th1/Th2细胞水平，并且上调Th1/Th2细胞因子水平，但其相关分子机制与靶标还需要进一步研究。