Toll样受体激动剂在变应性气道炎性疾病治疗中的研究进展①

刘佩强 许 昱（武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科，武汉 430060）

变应性哮喘和变应性鼻炎（AR）是目前最为常见的变应性气道炎性疾病，常将两者称为“同一气道，同一疾病”。在过去的几十年里，这两种疾病的发病率逐年增加［1］。为了开发更安全有效的免疫疫苗或新的独立疗法，先天性免疫的模式识别受体（PRRs）成为重要的研究目标［2-3］。Toll样 受 体（TLRs）是识别入侵病原体的常见PRRs，并协调随后的免疫反应。在哮喘和AR患者中，TLRs的表达和功能与健康受试者显著不同，这种免疫防御的差异可能是患者呼吸道易感性原因之一［4-5］。后续研究发现，TLRs可作为干预免疫反应进程的靶点，TLRs激动剂可通过诱导免疫耐受或气道免疫反应向Th1分化来阻止变应性气道疾病的进展，为恢复过敏患者气道保护性免疫反应提供了切实的希望［5-6］。目前，TLRs激动剂在变应性气道疾病的研究主要集中在TLR的2、4、7、8、9亚型，下文将重点阐述。

1 TLR2激动剂

TLR2位于胞膜上，通常与TLR1形成异源二聚体来识别脂蛋白、肽聚糖等细菌来源的配体。TLR2激动剂Pam3Cys和Pam3CSK4是生物合成的三酰化脂蛋白，可作为抗过敏剂或免疫佐剂。雾化吸入Pam3Cys使卵清蛋白（OVA）致敏小鼠出现哮喘且短暂性加重，但随后气道高反应减轻或消失，嗜酸性粒细胞显著减少，肺浸润的调节性T细胞（Treg）数量 增加［7］。Pam3Cys也可增 加CD80和CD86的 表达，促进树突状细胞（DCs）的激活，随后增加支气管肺泡中干扰素-γ（IFN-γ）的产生，而IFN-γ能有效抑制Th2反应，抑制嗜酸粒细胞的活化、分化和募集［8］。另一方面，经鼻给药Pam3CSK4可抑制2型肺泡细胞产生的IL-33来缓解慢性哮喘症状，既减轻急性感染的严重程度，也可下调Th2炎症反应［9］。此外，无论是在特异性免疫治疗（SIT）期间还是在SIT之后较长时间，Pam3CSK4可改善鼻症状评分，降低鼻呼气一氧化氮（nNO）水平［10］；Pam3CSK4在体外刺激来源于哮喘或AR患者的外周血单核细胞（PBMCs）后，CD8+CD25+Foxp3+Treg数量增多，并抑制CD4+T细胞增殖和Th2细胞因子的产生，因此可能作为SIT的良好佐剂［10-11］。

支原体巨噬细胞活化脂肽-2（MALP-2）是从发酵支原体中获得的TLR2/6激动剂。MALP-2可诱导B细胞和DCs中CD80、CD86、CD40以及主要组织相容性复合体Ⅰ和Ⅱ的表达，也增加DCs释放IFN-γ的能力［12］。在小鼠哮喘模型中，经雾化吸入MALP-2可使气道高反应、嗜酸性粒细胞和Th2细胞因子显著降低。同时，MALP-2促进气道中性粒细胞增多和IL-12 p70亚基的产生，并产生趋化因子，刺激T细胞、B细胞和NK细胞在小鼠的肺内积聚［13］。此外，BPPcysMPEG是MALP-2的 衍生物，也能刺激TLR2/6。在离体的肺组织切片中，BPPcysMPEG通过诱导产生IL-1β、趋化因子4（CCL4）和IL-10发挥免疫调节作用。在OVA致敏小鼠中，体内和局部给予含过敏原的BPPcysMPEG可使DCs成熟，并诱导其对过敏原产生适应性免疫应答［14］。在尘螨致敏的小鼠中，BPPcysMPEG还能减少嗜酸性粒细胞和Th2细胞因子的产生，并增强TNF-α和IFN-γ的生成，同时在支气管肺泡和纵隔淋巴结中诱导Th1反应［15］。上述研究提示，TLR2激动剂可在体内外诱导Treg产生，消除Th2反应，同时也有望成为有效的免疫佐剂。

2 TLR4激动剂

TLR4位于胞膜上，以TLR4为靶点治疗哮喘或AR，其应用基础是TLR4激动剂作为免疫佐剂来诱导耐受。单磷脂酰脂A（MPL）是一种TLR4激动剂，来自沙门氏菌脂多糖（LPS）的解毒衍生物，是FDA唯一批准用于AIT的第二代佐剂［16］。MPL是LPS经水解和随后色谱分析法得到的，它有一个磷酸基和六个酰基侧链，但没有多糖侧基。因此，MPL保留了LPS的免疫调节特性，但没有其毒性［17］。MPL是人类疫苗中批准的第一种TLR激动剂，已被用于许多疫苗制剂中，尤其是在乙型肝炎和人乳头状瘤病毒疫苗中，不良事件的发生率极低［18］。自1999年以来，过敏患者已接受以MPL为佐剂的过敏疫苗临床治疗［19］。有研究发现，MPL刺激TLR4后，DCs成熟并产生细胞因子，尤其是IL-12，可促进T细胞向Th1分化［20］。一项针对13例花粉过敏患者PBMCs的实验发现，植物花粉提取物和MPL的体外刺激可诱导IFN-γ增加，而IL-5减少。当添加抗IL-12的中和抗体时，可抑制大约95%的IFN-γ产生。这也提示，MPL以IL-12和单核细胞依赖的方式使Th2向Th1偏移［21］。另外，MPL使哮喘患者肺部炎症减少，如呼气中的8-异前列腺素等氧化应激标志物减少，且无危险副作用报告［22］。

CRX-675是一种水性MPL化合物，是抗过敏治疗的独立鼻内制剂。经鼻给药CRX-675仅在100μg剂量下就能减轻AR患者的鼻部症状，14 d的使用期内耐受良好且安全。CRX-675能降低小鼠哮喘模型中血清总IgE水平、气道高反应、气道嗜酸性粒细胞和IL-13［23］。另外，TLR4激动剂聚谷氨酸（γ-PGA）从杆菌细胞壁获得，诱导DCs上共刺激分子CD80、CD86和CD40的表达，并上调IL-12，可抑制Th2细胞因子、气道高反应和嗜酸性粒细胞［24］。ER-803022是一种合成的新型TLR4激动剂，其抑制气道高反应、气道嗜酸性粒细胞的产生，促进IL-12、IFN-γ的产生以及通过TLR4/MyD88途径抑制Th2细胞因子产生［25］。UT12是另一种与TLR4/MD-2复合物结合的单克隆激动性抗体，它可以在不诱导Treg或Th1细胞因子的情况下，通过消除Th2和Th17细胞因子的产生来抑制变应性气道炎症［26］。因此，TLR4激动剂既作为成熟的免疫佐剂，还抑制Th2反应，从而改善过敏症状。

3 TLR7/8激动剂

TLR7位于胞内，与TLR8形成异源二聚体来识别病毒来源的单链RNA。局部应用TLR7激动剂咪喹莫特后，小鼠肺泡巨噬细胞、B细胞和TNF-α的产生减少，DCs和NK细胞在肺组织中蓄积，并诱导IL-10的产生［27］。咪喹莫特也可激活小鼠哮喘模型中一氧化氮、前列腺素和钙激活钾通道，发挥支气管扩张的作用［28］。瑞喹莫德（R848）是一种TLR7/8激动剂，是治疗气道炎性疾病很有前景的免疫佐剂。rBet v1疫苗联合R848的皮下免疫刺激特异性Th1反应，有效抑制了桦树花粉诱导的哮喘［29］。Der f1疫苗联合R848在抑制过敏性哮喘方面显示出较强的治疗效果［30］。R848也可作为独立治疗方法，鼻内应用能有效抑制哮喘特征，如气道高反应性、气道炎症、黏液过度分泌，显著降低IL-5、IL-13和IL-17的水平，并通过诱导IFN-γ和IL-27来抑制小鼠哮喘的发作［31］。有研究发现，T细胞免疫球蛋白黏蛋白1/3（TIM1/3）与Th2介导的过敏性炎症有关，而R848可诱导的AR小鼠鼻黏膜TIM1/3表达下调，显著减少嗜酸性粒细胞浸润和杯状细胞增生，下调血清和鼻黏膜IL-13、IL-17水平，增加Th1和Treg细胞比例，降低Th2和Th17细胞比例，并减轻AR小鼠的鼻部症状［32-33］。此外，R848可诱导AR小鼠PBMCs中IL-10和IFN-γ表达上调［33］。又有发现，TLR7基因缺失诱导气道上皮细胞中IL-25、IL-33和胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）表达升高，2型先天淋巴样细胞（ILC2s）募集以及Th2型细胞因子产生增加，而R848可通过调节IL-25、IL-33表达水平来缓解AR［33］。另外，R848可通过诱导IFN-γ和记忆性CD8+T细胞的产生，促进实验动物哮喘的长期保护作用。与咪喹莫特相似，R848具有抗病毒和平喘作用，可用于治疗病毒加重的哮喘［34］。

AZD8848是一种新型的TLR7激动剂，是第一个经鼻给药的免疫调节化合物。为了限制药物对给药部位的影响，并尽可能减少全身细胞因子产生的相关潜在副作用，AZD8848被设计为一种前体药物。这种代谢不稳定的酯类是局部活性的，但在进入循环时被丁基胆碱酯酶迅速水解为活性低得多的代谢产物。鼻内应用AZD8848使AR患者鼻灌洗液中IL-1α增多，肥大细胞类胰蛋白酶和α2-巨球蛋白减少，这提示血浆渗出和肥大细胞活性降低［35］。在一项AR的Ⅱa临床试验中，AZD8848更多的给药次数并没有优势，一周内鼻腔给药20μg三次与60μg一次相比，出现不良反应更频繁［36］。在过敏性哮喘患者中，AZD8848经鼻给药可能通过刺激1型干扰素反应来降低Th2反应，从而缓解过敏反应。在为期8周的治疗过程中每周给药一次，一般耐受性良好，并且最大程度降低肺局部炎症反应的风险，减轻全身反应的风险［37］。VTX-1463是另一种TLR8激动剂，经5次鼻内治疗后，草花粉过敏的AR患者鼻部症状减轻，且无任何副作用［38］。在过敏原暴露后24 h，单剂量VTX-1463（500 mg）可降低鼻灌洗液中嗜酸性粒细胞以及肥大细胞的促炎性介质（组胺、cysLTs、PGD2），缓解鼻部对过敏原的早期反应。VTX-1463在过敏原暴露前使用是有效的，但考虑到其作用起效相对较快，因此可能作为加重期或常年AR患者对症治疗的辅助手段［39］。上述研究结果提示，TLR7/8激动剂具有成为哮喘预防和治疗性药物的潜力。

4 TLR9激动剂

TLR9位于胞内，其作用与TLR7相似，经MyD88途径调节Th2/Th1平衡，缓解气道过敏反应、抑制气道重塑，TLR9激动剂可能会成为下一代哮喘辅助治疗药物。合成的TLR9激动剂CPG-ODNs可刺激B细胞、NK细胞和特异性抗原呈递细胞增殖，并分泌多种细胞因子、趋化因子和免疫球蛋白［40］。同时，CPG-ODNs通过减少气道胶原沉积、金属蛋白酶活性和血管再生来抑制气道重塑，也增加有效抗原呈递必要结构蛋白的表达，增强免疫系统抵抗入侵病原体的能力［40］。有研究发现，CPG-ODNs可降低小鼠哮喘模型支气管肺泡中嗜酸性粒细胞、IL-4、IL-5和IgE的产生，并提高IL-10水平［41］。在皮下或黏膜致敏的情况下，CPG-ODNs减少气道过敏的发生［42］。然而，严重哮喘小鼠在给予CpG-ODNs后并未受益，Th2免疫反应和气道高反应在治疗后均未缓解。同样，严重哮喘时CPG-ODNs对产生IL-12或IFN-γ的反应较低，未对气道高反应性和气道平滑肌产生任何影响［43］。另有研究发现，经12次鼻内应用1018 ISS（CpG-ODNs类似物）后，支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞和IL-4、IL-5、IL-13水平明显降低，这提示短期的1018 ISS治疗可能持续抑制相关过敏原引起的肺部炎症［44］。另外，QbG10是A型CpG-ODNs，已在屋尘螨过敏的AR患者中作为单一疗法或免疫疫苗配方进行了测试，能减轻AR患者的症状，同时满足患者的药物需求，提高患者的生活质量。此外，持续性过敏性哮喘患者类固醇药物停用后，QbG10可改善患者的整体哮喘症状［45］。

过敏原-TLR9免疫刺激DNA序列结合物（AIC）在临床治疗上也很有希望。季节性花粉暴露后，AIC短期治疗增加AR患者鼻黏膜CD4+CD25+Treg细胞浸润，可减少Th2反应［46］。经AIC处理后，随着Th1/Th2比值的升高，IgE的生成量可能出现短暂的增加，然后优势型IgE向IgG转变。但是在后续的临床试验中AIC并没有减少AR患者的鼻部症状，对于AIC的起效时间和持续时间仍存在争议［47］。此外，它也未能减轻儿童的哮喘症状。最近，一种新的TLR9激动剂AZD1419被引入治疗哮喘和AR。AZD1419具有更强的药理活性，在动物模型中诱导对气道过敏反应的持久抑制，在临床试验中安全且耐受性良好。同时，AZD1419能诱导强大IFN信号，这可能直接解决Th2反应的失调并影响气道炎症进展［48］。然而，也有研究显示，部分TLR9激动剂对哮喘治疗无效［49］，关于TLR9激动剂的作用仍需更多数据验证。

5 小结与展望

几乎所有的TLRs都在气道炎症的发展过程中发挥前哨作用，是调节变应性疾病自然进程的重要靶点。某些TLRs激动剂表现出较强的免疫原性，使它们适合作为免疫疫苗的佐剂；而某些TLRs激动剂可作为单独的治疗方法来缓解哮喘和AR的症状。然而，仍有许多问题待解决。目前的大多数临床试验都是在成人受试者上进行的，而TLRs激动剂对过敏儿童的治疗有效性证据不足。其次，尽管TLRs激动剂在抑制气道高反应和气道重塑方面有很好的应用前景，但通常用于轻度至中度哮喘，应用于重症哮喘仍有待进一步研究。此外，由于不适当的给药可能会导致过度的免疫反应，存在有关靶向TLRs的最佳配方的时间、剂量、患者选择等其他问题。目前对于TLRs激动剂在变应性气道疾病中作用的研究主要集中在下气道方面，而对于以鼻部炎症为代表的上气道疾病才刚刚起步。现已知晓，AR与哮喘有着密切的联系，即所谓“联合气道疾病”。因此，应该重视上、下气道炎症反应的相关性以及AR和哮喘协同治疗的临床意义。这也提示我们应针对TLRs激动剂在气道变应性炎症中的作用及机制进行更加深入的研究，从而为临床干预AR和哮喘等变应性气道疾病探索新的途径。